Um ensaio in vitro para quantificar o crescimento intracelular do parasita em macrófagos

Pegue duas microplacas contendo lamínulas com macrófagos derivados da medula óssea ou BMMs.

Adicione promastigotas metacíclicos de Leishmania - o estágio flagelado alongado - em uma placa e amastigotas - o estágio oval não flagelado - em outra placa.

Durante a incubação, os parasitas se ligam aos receptores de macrófagos, desencadeando a fagocitose mediada por receptores.

O fagossomo se funde com os lisossomos e vesículas derivadas do retículo endoplasmático e do aparelho de Golgi, amadurecendo em um vacúolo parasitóforo.

A diminuição do pH do vacúolo desencadeia a diferenciação promastigota em amastigota e sua replicação.

Lave para remover parasitas não internalizados.

Fixe os macrófagos infectados e adicione detergente para permeabilizar as células e parasitas.

Introduza um corante de ácido nucleico fluorescente para corar os núcleos de macrófagos e parasitas.

Monte as lamínulas nas lâminas e observe ao microscópio de fluorescência, quantificando os núcleos hospedeiros maiores e os núcleos amastigotas menores circundantes.

Compare o número de amastigotas para avaliar sua multiplicação dentro de macrófagos inicialmente infectados com promastigotas indiferenciados versus aqueles infectados com amastigotas replicativas.

Para infectar as células com L. Amazonensis, dilua a suspensão do parasita para a multiplicidade experimental apropriada de infecção e adicione 50 a 100 microlitros de parasitas a cada poço de todas as placas de 6 poços, incluindo todos os pontos de tempo do experimento. Incubar os macrófagos derivados da medula óssea durante o período de infecção e a temperatura adequados. Em seguida, lave os poços três vezes com 2 mililitros de PBS fresco a 37 graus Celsius sem cálcio ou magnésio por poço e fixe as amostras iniciais com 1,5 a 2 mililitros de paraformaldeído a 2% por 10 minutos.

Para as placas correspondentes aos pontos de tempo posteriores, adicione 2 mililitros de meio macrófago fresco derivado da medula óssea a cada poço e retorne as placas à incubadora apropriada. Em seguida, fixe e lave as células para cada ponto de tempo restante, conforme demonstrado, e armazene as amostras a 4 graus Celsius em PBS fresco.

Para corar as células com DAPI, substitua o sobrenadante por 1,5 mililitros de PBS fresco sem cálcio e magnésio, suplementado com detergente não iônico a 0,1% por 10 minutos em temperatura ambiente, seguido de três lavagens de 2 mililitros com PBS sem cálcio ou magnésio. Em seguida, core as células com 2 microgramas por mililitro de DAPI em 1 mililitro de PBS por 1 hora em temperatura ambiente.

Após três lavagens, coloque as lamínulas com o lado da célula voltado para baixo em lâminas de microscópio de vidro individuais montadas com um reagente de montagem antidesbotamento disponível comercialmente. Em seguida, para quantificar o número de células infectadas, use a objetiva de óleo de imersão 100x de um microscópio de fluorescência e contador Emanuel, para identificar o número de núcleos amastigotas menores agrupados em torno de cada grande núcleo de macrófago corado com DAPI.