Um ensaio de liberação de corante para quantificar a atividade enzimática de proteínas antimicrobianas

Comece com um tubo contendo suspensão bacteriana morta pelo calor e trate com uma solução de corante.

As moléculas de corante se ligam covalentemente ao peptidoglicano - um componente essencial da parede celular bacteriana, conferindo uma coloração azul.

Pulverize as bactérias e remova o sobrenadante contendo moléculas de corante não ligadas.

Ressuspenda as bactérias e introduza uma solução de proteína antimicrobiana no tubo, desencadeando a hidrólise enzimática do peptidoglicano bacteriano, resultando na degradação da parede celular seguida de lise celular.

Isso leva à liberação das moléculas do corante, conferindo coloração azul.

Adicione etanol - um agente desnaturante de proteínas, inativando as proteínas antimicrobianas e encerrando a reação enzimática.

Centrifugue o conteúdo para pellet os fragmentos celulares e enzimas. Transfira o sobrenadante contendo a molécula de corante para uma placa de vários poços.

Usando um leitor de placas, meça a absorbância em 595 nanômetros.

Comparar a absorvância da amostra tratada com a enzima com a da amostra não tratada com a enzima, a fim de quantificar a actividade enzimática da proteína antimicrobiana.

No ensaio de liberação do corante, o substrato é covalentemente ligado ao corante Remazol Brilliant Blue R ou RBB. Comece este protocolo fazendo uma solução RBB de 200 milimolares. Dissolva 1,25 gramas de RBB em uma solução de hidróxido de sódio recém-preparada.

Em seguida, ressuspenda as células bacterianas mortas pelo calor a uma concentração de 0,5 gramas de peso úmido em 30 mililitros de solução RBB. Para peptidoglicano purificado, ressuspenda o peptidoglicano na concentração de 0,3 gramas de peso úmido e 30 mililitros de solução de RBB.

Como as etapas subsequentes são as mesmas, independentemente do substrato usado, a marcação será demonstrada apenas para as células bacterianas. Incube a mistura de reação em uma plataforma rotativa por seis horas a 37 graus Celsius com uma mistura suave. Após seis horas, transfira a mistura de reação para uma incubadora de 4 graus Celsius e incube por mais 12 horas com uma mistura suave.

Quando a incubação estiver completa, colher o substrato tingido por centrifugação a 3.000 vezes g por 30 minutos. Transvase a solução de corante do sedimento de substrato. Ressuspenda completamente o pellet em água tipo 1 seguida de centrifugação. Lave as células marcadas com corante três a cinco vezes dessa maneira para remover o corante solúvel não covalentemente ligado dos substratos.

Para as lavagens finais, transfira a porção do pellet que será usada no ensaio de liberação de corante para tubos de microcentrífuga de 1,5 mililitro. O sobrenadante da última lavagem deve ser límpido, enquanto o substrato permanece azul. Armazene o substrato tingido suspenso em uma quantidade mínima de água a 20 graus Celsius negativos até que esteja pronto para uso.

Para se preparar para o ensaio de liberação de corante, deixe o substrato tingido congelado retornar à temperatura ambiente e lave duas vezes com o tampão de ensaio que foi determinado empiricamente para a enzima. PBS é usado, neste caso. Calcule o volume da suspensão de substrato necessário multiplicando o volume de reação de 200 microlitros pelo número de ensaios de liberação de corante a serem realizados.

Para preparar a suspensão do substrato, primeiro adicione o substrato tingido ao volume apropriado de PBS. Faça uma diluição de um para um e faça uma medição inicial da densidade óptica em 595 nanômetros usando PBS como um branco. Adicionar quantidades incrementais do substrato tingido à suspensão até obter uma densidade óptica de 2,0 a 595 nanômetros.

Nesta demonstração, o ensaio de liberação de corante será usado para determinar as condições ideais de incubação para um antimicrobiano proteico. Primeiro, prepare uma suspensão antimicrobiana de proteína estoque ajustando a concentração para 1 miligrama por mililitro usando PBS, conforme descrito no texto do protocolo. Em seguida, dilua a suspensão antimicrobiana de proteína estoque a uma concentração de 100 nanogramas por microlitro.

Esta concentração dá uma massa de reação final de 1 micrograma de proteína por volume adicionado à reação do ensaio. Realize os ensaios de reação em tubos de microcentrífugas de 0,5 mililitro para a faixa térmica a ser avaliada. Para cada condição térmica, adicione 10 microlitros da proteína estoque a 200 microlitros de suspensão de substrato preparada.

Incubar em um termociclador por oito horas com mistura por inversão uma vez por hora. Após a incubação, interrompa as reações adicionando 25 microlitros de etanol a cada tubo de microcentrífuga. Para remover o substrato insolúvel não digerido, centrifugue a 3.000 vezes g por dois minutos. Depois disso, tomando cuidado para não romper o pellet de substrato não digerido, transfira 150 microlitros do sobrenadante de reação para cada mistura de reação para uma microplaca de fundo plano de 96 poços.

Para quantificar a atividade enzimática, use um espectrofotômetro de microplacas para medir a absorbância do sobrenadante em 595 nanômetros. O aumento da absorbância pelo corante solúvel liberado no sobrenadante a partir do substrato marcado é uma medida quantitativa da atividade enzimática.