Um ensaio de liberação de corante para quantificar a atividade enzimática de proteínas antimicrobianas

Comece com um tubo contendo suspensão bacteriana morta pelo calor e trate com uma solução de corante.

As moléculas de corante se ligam covalentemente ao peptidoglicano - um componente essencial da parede celular bacteriana, conferindo uma coloração azul.

Pulverize as bactérias e remova o sobrenadante contendo moléculas de corante não ligadas.

Ressuspenda as bactérias e introduza uma solução de proteína antimicrobiana no tubo, desencadeando a hidrólise enzimática do peptidoglicano bacteriano, resultando na degradação da parede celular seguida de lise celular.

Isso leva à liberação das moléculas do corante, conferindo coloração azul.

Adicione etanol - um agente desnaturante de proteínas, inativando as proteínas antimicrobianas e encerrando a reação enzimática.

Centrifugue o conteúdo para pellet os fragmentos celulares e enzimas. Transfira o sobrenadante contendo a molécula de corante para uma placa de vários poços.

Usando um leitor de placas, meça a absorbância em 595 nanômetros.

Comparar a absorvância da amostra tratada com a enzima com a da amostra não tratada com a enzima, a fim de quantificar a actividade enzimática da proteína antimicrobiana.

No ensaio de liberação do corante, o