JoVE Encyclopedia of Experiments
Imunologia
0 vistas • 5:10 min • July 8th, 2025
Trate as cepas bacterianas produtoras de piomelanina e não produtoras de piomelanina com um agente de teste.
A piomelanina, um pigmento extracelular, fornece proteção contra o estresse oxidativo.
O agente de teste interrompe a biossíntese de piomelanina, reduzindo sua produção.
Pós-incubação, realizar diluições bacterianas seriadas com um tampão contendo o agente de teste ou solvente do veículo.
Identifique diluições bacterianas em placas de ágar com concentrações variáveis de peróxido de hidrogênio - um estressor oxidativo.
Placas sem peróxido de hidrogênio servem como controles.
incubar. Nas placas de controle, as bactérias formam colônias.
Na cepa produtora de piomelanina não tratada, a piomelanina protege as bactérias do dano oxidativo induzido pelo peróxido de hidrogênio, resultando em colônias pigmentadas.
No entanto, a cepa produtora de piomelanina tratada com o agente de teste, exibindo piomelanina reduzida, torna-se sensível ao estresse oxidativo, resultando em morte bacteriana.
Conte colônias.
A contagem e o tamanho reduzidos das colônias com o aumento das concentrações de peróxido de hidrogênio nas cepas produtoras de piomelanina tratadas e não tratadas não produtoras de piomelanina do que os controles indicam maior sensibilidade bacteriana ao estresse oxidativo.
Para iniciar este procedimento, configure culturas durante a noite das cepas a serem testadas em LB, com e sem NTBC. No dia seguinte, prepare placas de ágar LB contendo peróxido de hidrogênio como estressor oxidativo. Primeiro, derreta os frascos de ágar LB e resfrie o meio a aproximadamente 50 graus Celsius à temperatura ambiente.
Em seguida, adicione peróxido de hidrogênio diretamente ao meio resfriado nas concentrações desejadas. Agite o frasco para misturar. Uma faixa de concentrações de peróxido de hidrogênio de 0 a 1 milimolar é um bom ponto de partida. Despeje os pratos imediatamente e chame a superfície para remover as bolhas. O rendimento é de quatro placas por 100 milímetros de ágar LB. Marque as placas com a concentração de peróxido de hidrogênio.
Coloque as placas descobertas em uma coifa de fluxo biológico, com um ventilador funcionando por 30 minutos para remover o excesso de umidade das placas. As placas devem ser usadas no mesmo dia em que são preparadas. Enquanto as placas estão secando, lave e meça o OD600 das culturas noturnas.
Normalize o OD600 de todas as culturas noturnas para o valor mais baixo para o conjunto de cepas que estão sendo testadas. Para fazer isso, determine o volume de cultura necessário para diluir a cultura para o OD600 mais baixo em um volume total de 1 mililitro.
Por exemplo, se uma cultura tiver um OD600 de 3 e o OD600 mais baixo para o conjunto de cepas for 2,5, execute o seguinte cálculo, que resultará em 0,833 mililitros como o volume de cultura necessário. Coloque 0,833 mililitros de cultura em um tubo de microcentrífuga. Em seguida, calcule a quantidade de LB mais NTBC ou LB mais DMSO necessária para levar o volume de cultura a 1 mililitro. Neste exemplo, a quantidade seria de 0,167 mililitros. Misture por vórtice.
Para manter as culturas em uma concentração constante de NTBC ou DMSO, execute diluições seriais de 10 vezes das culturas normalizadas durante a noite em PBS mais NTBC ou PBS mais DMSO. Faça soluções de estoque de PBS mais NTBC e PBS mais DMSO aumentando ou diminuindo, dependendo de quantas cepas são testadas.
Para um conjunto de diluições para uma cepa, misture 300 micromolares de NTBC ou um volume equivalente de DMSO com PBS para obter um volume total de 720 microlitros. Adicione 90 microlitros de PBS mais NTBC ou PBS mais DMSO aos tubos de microcentrífugas apropriados rotulados para 10 a menos 1 a 10 a menos 7 diluições em série. Adicionar 10 microlitros de cultura aos 10 adequados ao tubo de diluição menos 1.
Misturar por vórtice e transferir 10 microlitros da diluição de 10 para menos 1 para o tubo de diluição de 10 para menos 2. Trocando as pontas da pipeta entre as diluições, repita até que todas as diluições tenham sido realizadas.
Identifique 5 microlitros das diluições de 10 a menos 3 a 10 a menos 7 em placas de LB mais peróxido de hidrogênio em duplicata para cada cepa. Use uma ponta de pipeta se as manchas forem plaqueadas para diluir mais a menos diluir. Não incline ou incline a placa até que o líquido seque na placa. Incube as placas a 37 graus Celsius. Por 24 a 48 horas, dependendo da cepa. Assim que as colônias de bom tamanho aparecerem, fotografe as placas usando uma câmera CCD acima de um transiluminador.