Avaliando a eficácia de um composto de teste contra micobactérias em caldo

Pegue uma placa de vários poços contendo diluições em série do composto de teste, um antibiótico aminoglicosídeo.

Adicione uma suspensão de Mycobacterium tuberculosis - uma bactéria patogênica - nos poços e incuba.

No citoplasma, o composto de teste se liga à subunidade ribossômica micobacteriana 30S, inibindo a síntese normal de proteínas e, eventualmente, levando à morte micobacteriana.

Após a incubação, adicione resazurina - um corante solúvel em água fracamente fluorescente, às culturas. Incubar.

Dentro de micobactérias metabolicamente ativas viáveis, as enzimas desidrogenase reduzem a resazurina de cor azul a uma resorufina fluorescente de cor rosa.

Usando um leitor de placa de fluorescência, meça a intensidade de fluorescência da resorufina nos poços.

Um baixo valor de intensidade de fluorescência com concentrações crescentes do composto de teste sugere seus efeitos citotóxicos contra as micobactérias.

Para realizar um ensaio de resazurina, cultive M. tuberculosis na fase 7H9ADST até o meio do log. Diluir a cultura com 7H9ADST até obter uma DO₆₀₀ de 0,01. Use 7H9ADST para diluir os compostos para duas vezes as concentrações de teste e alíquota de 100 microlitros de cada composto diluído em cada poço de uma placa transparente de 96 poços.

Transfira 100 microlitros da suspensão bacteriana diluída para cada poço. Incube as placas a 37 graus Celsius em uma incubadora umidificada por 5 dias. Dissolva 10 miligramas de resazurina em 100 mililitros de água deionizada e esterilize a solução com filtro. Adicione 30 microlitros de solução de resazurina aos poços. Em seguida, incube as células por 48 horas.

O crescimento bacteriano é indicado por uma conversão de cor de azul para rosa. Realize análises quantitativas de acordo com o protocolo de texto.