Enciclopédia de Experimentos da JoVE
Imunologia
0 visualizações • 6:41 min. • July 8th, 2025
Pegue uma placa de microtitulação com uma tampa com suportes cilíndricos, ou pinos, revestidos com biofilmes bacterianos.
Coloque a tampa de pino revestida com biofilme nos poços da placa de microtitulação com tampão para eliminar bactérias frouxamente aderidas ou planctônicas, concentrando-se nas medições anexadas ao biofilme.
Transfira a tampa de pino revestida de biofilme lavada para uma placa de desafio com concentrações crescentes de agente antibacteriano de teste. Incubar sem agitar.
Dependendo da concentração do agente e do potencial antibacteriano, ele interrompe a atividade metabólica bacteriana e a integridade do biofilme.
Após a incubação, coloque a tampa do pino nos poços da placa contendo tampão para remover as bactérias planctônicas.
Transfira-o para poços de placas de microtitulação com um meio de recuperação de biofilme contendo resazurina, um corante fracamente fluorescente permeável às células. Incubar.
Em bactérias metabolicamente ativas, as enzimas desidrogenase reduzem a resazurina de cor azul em resorufina fluorescente de cor rosa.
A falta de conversão de resazurina indica erradicação do biofilme, enquanto a conversão em resorufina sugere a presença de células viáveis.
A menor concentração de agente antibacteriano de teste que não produz conversão de resazurina denota a concentração mínima de erradicação de biofilme.
Pegue uma nova placa de 96 poços e adicione 100 microlitros de CRPMI equilibrados à temperatura ambiente a cada poço das fileiras B a H. Dilua até quatro compostos de teste separadamente em 1,0 mililitro de CRPMI até 2x a concentração final desejada. Adicione 200 microlitros do composto um nos poços A1 a A3, 200 microlitros do composto dois nos poços A4 a A6, 200 microlitros do composto três nos poços A7 a A9 e 200 microlitros do composto quatro nos poços A10 a A12.
Diluir em série os compostos de teste usando uma pipeta multicanal. Comece transferindo 100 microlitros da linha A para a linha B e misture. Dessa forma, continue a transferir 100 microlitros de poço para poço. Misturar após cada transferência e parar na linha F. Após a mistura, expulse 100 microlitros da fileira F para um recipiente de resíduos. Não transfira nenhum líquido para as fileiras G e H. Por fim, adicione 100 microlitros de CRPMI a cada poço da placa usando uma pipeta multicanal, para elevar o volume final para 200 microlitros.
Adicione 200 microlitros de solução salina tamponada com fosfato a uma placa fresca e estéril de 96 poços que apresenta poços com dimensões idênticas às da placa de iniciação do biofilme. Em seguida, remova o saco plástico e o filme de parafina da placa de iniciação do biofilme incubado. Levante a tampa para cima, evitando o contato entre os pinos e o fundo da placa, pois isso pode danificar o biofilme. Guarde a parte inferior para análise subsequente do OD600.
Enxágue as células planctônicas colocando a tampa do pino na placa contendo PBS. Mergulhe os pinos por 5 segundos, retire-os do PBS e mergulhe mais uma vez, tomando cuidado para não bater nos pinos contra os lados do poço. Coloque a tampa do pino enxaguada na placa de desafio. Evite o contato desnecessário entre os pinos e a placa inferior, pois isso danificará o biofilme, levando a resultados inconsistentes.
Sele a placa com filme de parafina e coloque em um saco plástico lacrado como antes. Incube a placa sem agitar por 24 horas a 37 graus Celsius em uma incubadora de 5% de dióxido de carbono. Pegue a parte inferior da placa de iniciação do biofilme e ressuspenda as bactérias em cada poço usando uma pipeta multicanal. Meça o OD600 com um leitor de microplacas adequado para confirmar o crescimento que ocorre em todos os poços, mas os controles de esterilidade na linha H.
Use um leitor de placas equipado com uma câmara de incubação e capaz de fazer leituras de fluorescência cinética para detectar a conversão de resazurina. Configure uma medição de fluorescência cinética de 24 horas usando uma excitação de 530 nanômetros e uma emissão de 590 nanômetros. Defina a temperatura da câmara para 37 graus Celsius e faça a leitura da placa a cada 20 minutos.
Defina o leitor de placas para medir a partir do fundo da placa, de acordo com as instruções do fabricante. Prepare-se para lavar a placa adicionando 200 microlitros de PBS a cada poço de uma placa estéril de 96 poços com uma pipeta multicanal. Em seguida, prepare o meio de recuperação de biofilme adicionando 400 microlitros de 0,8 miligrama por mililitro de solução estoque de resazurina a 20 mililitros de meio CRPMI, até uma concentração final de 16 microgramas por mililitro de resazurina.
Em seguida, adicione 150 microlitros de meio de recuperação de biofilme com uma pipeta multicanal, a cada poço de uma placa nova de 96 poços. Transfira a placa de desafio da incubadora para um gabinete de biossegurança e remova cuidadosamente o saco plástico e o filme de vedação. Remova a tampa do pino da placa de provocação e enxágue as células planctônicas em PBS como antes, mantendo o fundo da placa de provocação para análise subsequente de OD600.
Após o enxágue, coloque a tampa do pino no fundo da placa contendo o meio de recuperação de biofilme. Enrole a lateral da placa com filme de parafina, tomando cuidado para não obstruir o fundo dos poços perimetrais. Imediatamente após embrulhar a placa, coloque-a no leitor de placas e inicie uma leitura cinética durante um período de 24 horas, iniciando o protocolo cinético de resazurina feito anteriormente.