Enciclopédia de Experimentos da JoVE
Imunologia
0 visualizações • 4:34 min. • July 8th, 2025
Pegue uma microplaca contendo células de mamíferos no gelo.
Adicione um meio contendo cálcio aos poços selecionados e um meio sem cálcio aos demais.
Introduzir monômeros de uma toxina bacteriana formadora de poros. Uma temperatura baixa impede a agregação de monômeros, facilitando a ligação ao colesterol da membrana celular.
Incubar a uma temperatura fisiológica, permitindo que os monômeros ligados ao colesterol oligomerizem e se insiram na membrana, formando um poro.
Em poços com cálcio extracelular, o poro causa influxo de cálcio.
O influxo desencadeia a liberação exossômica da toxina e o resselamento da membrana.
O aumento de cálcio intracelular também induz exocitose lisossômica, liberando uma enzima que converte a esfingomielina da membrana em ceramida.
A membrana enriquecida com ceramida desencadeia a endocitose da toxina, selando novamente a membrana.
O resselamento da membrana é dificultado em poços sem cálcio extracelular.
Adicione iodeto de propídio ou PI - um corante fluorescente - que não pode entrar nas células com uma membrana reparada, mas entra nas células danificadas para se ligar ao DNA, emitindo fluorescência.
Meça a fluorescência em intervalos definidos para ava
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