JoVE Encyclopedia of Experiments
Imunologia
0 vistas • 4:34 min • July 8th, 2025
Pegue uma microplaca contendo células de mamíferos no gelo.
Adicione um meio contendo cálcio aos poços selecionados e um meio sem cálcio aos demais.
Introduzir monômeros de uma toxina bacteriana formadora de poros. Uma temperatura baixa impede a agregação de monômeros, facilitando a ligação ao colesterol da membrana celular.
Incubar a uma temperatura fisiológica, permitindo que os monômeros ligados ao colesterol oligomerizem e se insiram na membrana, formando um poro.
Em poços com cálcio extracelular, o poro causa influxo de cálcio.
O influxo desencadeia a liberação exossômica da toxina e o resselamento da membrana.
O aumento de cálcio intracelular também induz exocitose lisossômica, liberando uma enzima que converte a esfingomielina da membrana em ceramida.
A membrana enriquecida com ceramida desencadeia a endocitose da toxina, selando novamente a membrana.
O resselamento da membrana é dificultado em poços sem cálcio extracelular.
Adicione iodeto de propídio ou PI - um corante fluorescente - que não pode entrar nas células com uma membrana reparada, mas entra nas células danificadas para se ligar ao DNA, emitindo fluorescência.
Meça a fluorescência em intervalos definidos para avaliar a eficiência de reselagem da membrana.
Para configurar um ensaio baseado em fluorescência de alto rendimento para as condições permissivas de reparo, lave as células duas vezes com 200 microlitros de meio M1 de 37 graus Celsius por poço e adicione 100 microlitros de meio fresco M1 de 37 graus Celsius suplementado com iodeto de propídio de 30 micromolares após descartar a segunda lavagem.
Para condições restritivas de reparo, lave as células uma vez com 200 microlitros de meio M2 a 37 graus Celsius suplementado com EGTA 5 milimolar por poço, seguido de uma lavagem com 200 microlitros de meio M2 sozinho.
Depois de descartar a segunda lavagem, adicione 100 microlitros de meio fresco M2 a 37 graus Celsius suplementado com iodeto de propídio 30 micromolar por poço. Em seguida, crie imagens da placa sob luz transmitida, GFP e PI, como acabamos de demonstrar. Enquanto a placa está sendo fotografada, coloque uma microplaca de polipropileno de fundo redondo de 96 poços no gelo e configure a placa conforme demonstrado para a placa anterior.
Para condições permissivas de reparo, adicione 100 microlitros de meio M1 gelado suplementado com iodeto de propídio 60 micromolar por poço, seguido pela adição de 100 microlitros de M1 gelado com ou sem 4x listeriolisina O por poço.
Para condições restritivas de reparo, adicione 100 microlitros de meio M2 gelado suplementado com 60 iodeto de propídio micromolar por poço, seguido pela adição de 100 microlitros de M2 gelado com ou sem 4x listeriolisina O por poço.
É imperativo preparar listeriolisina O na concentração experimental apropriada em gelo aproximadamente 5 minutos antes do início do ensaio cinético quando a placa 1 estiver no gelo e a placa 2 estiver sendo preparada.
Quando a primeira placa terminar de obter imagens, transfira-a imediatamente para uma folha de papel alumínio no gelo. Após 5 minutos, transfira 100 microlitros de cada poço da segunda placa para o poço correspondente apropriado na primeira placa resfriada, inserindo as pontas da pipeta abaixo do menisco da solução em cada poço antes de ejetar o volume sem misturar para distribuição adequada da toxina.
Deixe a toxina se ligar às células hospedeiras por 1 minuto e transfira imediatamente a primeira placa para o leitor de placas para o ensaio pós-cinético usando o modo espectrofluorômetro. No final do ensaio cinético, adquira imediatamente uma imagem pós-cinética da imagem da placa, conforme demonstrado para a imagem pré-cinética.