Imuno-histoquímica para estudar a relação entre macrófagos e células imunes infiltradas

0 vistas4:00 min • July 8th, 2025

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Comece com uma lâmina contendo seções de biópsia da artéria temporal fixadas em formalina, desparafinizadas e reidratadas com células imunes infiltradas, incluindo linfócitos e macrófagos.

Os macrófagos ativados expressam o receptor de folato beta ou FR-β - um marcador relacionado à doença, diferenciando os macrófagos de outras células imunológicas.

Transfira a lâmina para um tampão pré-aquecido para recuperar os receptores de superfície.

Trate a seção com peróxido de hidrogênio, bloqueando a atividade da peroxidase intracelular.

Introduza uma mistura de anticorpos primários direcionados a CD3, CD68 e FR-β, que se ligam às células imunes que expressam essas proteínas.

Adicione anticorpos secundários biotinilados, interagindo com anticorpos primários, e lave.

Sobreposição com enzimas conjugadas com estreptavidina que se ligam à biotina.

Trate com um substrato cromogênico que interage com enzimas, produzindo precipitados marrons localizados.

Introduza uma contracoloração - hematoxilina, corando os núcleos de azul.

Identifique microscopicamente células pequenas, redondas e coradas de marrom como linfócitos que expressam CD3 e células grandes, irregulares e coradas de marrom como macrófagos que expressam CD68 e FR-β.

Quantifique os macrófagos na seção para encontrar sua proporção entre o total de células imunes infiltradas.

Para recuperação de antígeno, transfira o rack para um recipiente de vidro com 200 microlitros de tampão de citrato a 95 graus Celsius, 10 milimolares por litro, por 30 minutos. No final da incubação, deixe as lâminas esfriarem até a temperatura ambiente por 20 minutos antes de enxaguar com água corrente por cinco minutos.

Para remover a atividade da peroxidase endógena, primeiro use um marcador hidrofóbico para desenhar um círculo ao redor de cada amostra de tecido, antes de incubar as amostras em 200 microlitros de peróxido de hidrogênio a 3% por 10 minutos, seguido de três lavagens em 200 microlitros de solução salina tamponada com Tris ou TBSS por lavagem. Após a última lavagem, enxugue cada lâmina suavemente para remover qualquer excesso de tampão e adicione 200 microlitros do coquetel de anticorpos primários de interesse e uma lamínula a cada lâmina para uma incubação de uma hora em uma câmara úmida em temperatura ambiente.

No final da incubação, descarte as lamínulas e lave as lâminas com três lavagens de dois minutos em TBSS fresco. Depois de remover o excesso de tampão, adicione 200 microlitros de uma solução apropriada de anticorpos secundários biotinilados e uma lamínula a cada lâmina para uma incubação de 45 minutos na câmara úmida à temperatura ambiente. Depois de descartar as lamínulas, enxágue as lâminas com TBSS, conforme demonstrado. Remova qualquer excesso de buffer.

Ative as seções com 200 microlitros de tampão de substrato DAB por 10 minutos em temperatura ambiente. No final da incubação, lave as lâminas com TBSS e água corrente da torneira por 10 minutos, antes de contra-corar com hematoxilina por três minutos. Em seguida, adicione 70 microlitros de um meio de montagem apropriado a cada lâmina e incline lentamente uma lamínula de vidro sobre o meio de montagem para evitar a criação de bolhas à medida que a lamínula é abaixada no lugar.

Para análise histopatológica, coloque a lâmina no palco de um microscópio óptico e avalie a arquitetura vascular da primeira seção de tecido. Em seguida, quantifique o número de macrófagos em relação ao número de linfócitos por seção.

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Última atualização: 15 agosto 2026