Um ensaio para análise do ciclo celular de células T CD8⁺ específicas do antígeno

Pegue células de órgãos linfóides secundários de um camundongo imunizado com antígeno, contendo células T CD8 ⁺ específicas do antígeno em diferentes estágios do ciclo celular.

G₁, S, G₂ e M são estágios de células em divisão ativa, enquanto as células no estágio G₀ são quiescentes.

Adicione um corante de viabilidade fluorescente para marcar células mortas e anticorpos marcados com fluoróforo ligando-se aos marcadores de superfície de células T CD3 e CD8.

Introduzir multímeros de peptídeo antigênico-MHC conjugados com fluoróforo para se ligar aos receptores de células T, marcando as células T específicas do antígeno.

Usando um tampão, fixe e permeabilize as células.

Introduza anticorpos marcados com fluoróforo para se ligar a uma proteína nuclear associada à proliferação celular - corando as células que se dividem ativamente.

Adicione uma coloração fluorescente para rotular o DNA.

Usando citometria de fluxo, selecione as células vivas e identifique as células T CD8 ⁺ específicas do antígeno por meio dos marcadores ligados à superfície.

A intensidade da coloração de DNA discrimina as células G₀ e G₁ com menor quantidade de DNA das células S, G₂ e M com maior quantidade de DNA. A ausência do anticorpo específico da proteína nuclear separa as células G₀.

Prepare o tampão de lavagem de permeabilização 1X fresco diluindo o tampão de permeabilização 10X com água destilada e filtre-o através de um filtro de 0,45 micrômetro para eliminar agregados. Diluir o anticorpo monoclonal Ki67-FITC em tampão de lavagem de permeabilização 1X, conforme determinado com um experimento de titulação para um volume final de 100 microlitros por amostra.

Adicione 3 mililitros do tampão de lavagem de permeabilização 1X a cada tubo com células e centrifugue a 400 g por 5 minutos em temperatura ambiente. Descarte o sobrenadante. Novamente, adicione o tampão de lavagem de permeabilização 1X e centrifugue para pellet as células e, em seguida, descarte o sobrenadante.

Adicione 100 microlitros de anticorpo monoclonal diluído Ki67-FITC ao pellet, em seguida, vórtice e incube por 30 minutos no escuro. Após a incubação, lave as células duas vezes com 4 mililitros de tampão de permeabilização 1X, centrifugando após cada lavagem, e descarte o sobrenadante.

Adicione 350 microlitros de PBS ao pellet celular para amostras a serem adquiridas diretamente no citômetro de fluxo e 250 microlitros de PBS ao pellet celular para amostras a serem incubadas com Hoechst para coloração de DNA. Preparar a solução de Hoechst e PBS e adicioná-la a cada amostra, de modo a que a concentração final seja de 2 microgramas por mililitro. Vórtice e incubar as amostras por 15 minutos no escuro. Em seguida, centrifugue as amostras por 5 minutos e adicione 350 microlitros de PBS ao pellet da célula.

Abra o software e crie diferentes grupos correspondentes aos diferentes órgãos a serem analisados clicando em Criar grupo na seção da faixa de opções do espaço de trabalho. Abra a janela Modificar grupo clicando duas vezes no nome do grupo e sincronize os grupos recém-criados inserindo uma marca de seleção na função Sincronizado.

Arraste cada arquivo FCS para seu grupo correspondente e, em seguida, crie uma estratégia de passagem começando com um grupo do LN. Abra a janela do gráfico clicando duas vezes na amostra totalmente corada para exibir os eventos não fechados adquiridos para esta amostra em um gráfico de pontos. Observe que os eixos x e y são rotulados como nos arquivos FCS, conforme indicado na Tabela 2 do arquivo de configurações do citômetro de fluxo deste manuscrito. Verifique se um número suficiente de eventos é exibido para visualização apropriada.

Se necessário, abra Preferências clicando no ícone de coração na faixa de opções da área de trabalho, selecione Gráficos, depois Gráfico de pontos como tipo de gráfico e verifique se o número de pontos desenhados na caixa correspondente está correto ou altere-o. Exiba os eventos não fechados na janela do gráfico em um gráfico de pontos com DNA-A no eixo x e DNA-W no eixo y. Use escala linear para ambos os eixos. Se necessário, altere a escala de logarítmica para linear clicando na caixa indicada com um T próximo a cada eixo na janela do gráfico.

Selecione uma única população de células clicando em Retângulo na seção Ferramentas de Gating e, em seguida, clique duas vezes no centro da porta retangular para exibir células únicas em um gráfico de pontos com o parâmetro FSC-A no eixo x e corante de célula morta no eixo y.

Clique no Polígono para selecionar a população de células vivas, que são negativas para corante de células mortas. Clique duas vezes no centro da porta de polígono para exibir as células em um gráfico de pontos com o parâmetro FSC-A no eixo x e o parâmetro SSC-A no eixo y.

Clique em Retângulo e crie uma porta "relaxada" para incluir todas as células ativas únicas nesse gráfico. Clique duas vezes no centro da porta relaxada para exibir as células em um gráfico de pontos com CD3 no eixo x e CD8 no eixo y.

Use a escala de eixo apropriada para visualização na janela do gráfico. Se necessário, modifique a escala x e y clicando na caixa indicada com um T próximo a cada eixo. Escolha Personalizar função de eixo e modifique Extra Neg Decades, Width Basis e Positive Decades conforme necessário.

Selecione as células CD3-positivas, CD8-positivas clicando em Polígono. Clique duas vezes no centro da porta CD3-positiva, CD8-positiva para exibir as células em um gráfico de pontos com Tetr-gag no eixo x e Pent-gag no eixo y. Selecione as células T CD8 específicas do antígeno clicando em Polígono. Clique duas vezes no centro da porta específica da mordaça para exibir as células em um gráfico de pontos com DNA-A no eixo x e Ki67 no eixo y. Selecione as células nas diferentes fases do ciclo celular clicando em Quad na seção Gating Tools da janela do gráfico.