Why does null hypothesis testing matter for microglial uptake quantification?

Null hypothesis testing ensures that observed differences in microglial phagocytosis are statistically significant, supporting robust target validation and reducing false positives in early discovery.

How does independent variable isolation fit the flow cytometry workflow?

Isolating variables such as cell type and viability through specific antibody labeling and gating enables precise attribution of phagocytic activity to microglia, strengthening mechanistic insights.

What do quantitative dependent variable measurements enable in this assay?

Quantitative fluorescence measurements allow for direct comparison of microglial uptake across conditions, facilitating data-driven decisions in screening and target prioritization.

Why are replication requirements critical for cross-functional collaboration?

Replicating flow cytometry results across experiments and teams ensures reproducibility, enabling reliable data sharing and integration into broader R&D workflows.

What statistical analysis capabilities are required before implementing flow cytometry readouts?

Robust statistical tools are needed to analyze multiparametric flow cytometry data, assess significance, and validate findings for downstream decision-making in biopharma pipelines.

Medindo a captação microglial de partículas fluorescentes entregues por via intravítrea usando citometria de fluxo

JoVE Encyclopedia of Experiments

Immunology

0 views • 4:34 min • July 8th, 2025

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Comece com uma placa de vários poços contendo uma suspensão de célula única de células mieloides da retina de camundongos, incluindo microglia, monócitos e neutrófilos.

Microglia - ou células imunes fagocíticas da retina, exibem fluorescência devido a biopartículas marcadas com fluoróforo de origem fúngica engolfadas, pré-injetadas intravítreas.

Centrifugue e adicione anticorpos receptores Fc, bloqueando locais de interação não específicos.

Introduza um coquetel de anticorpos marcados com fluoróforo direcionados às proteínas de superfície CD11b, Ly6C e Ly6G, interagindo com as células mieloides que as expressam.

Remova os anticorpos não ligados. Trate com iodeto de propídio, que permeia através de membranas danificadas, colorindo exclusivamente as células mortas.

Na citometria de fluxo, excite o iodeto de propídio para excluir as células mortas e identificar as células vivas não fluorescentes.

Ilumine as células com um laser violeta; células vivas excitadas significam as células mieloides que expressam CD11b.

Em seguida, ilumine com um laser vermelho, excitando o fluoróforo vermelho quase distante dentro das células CD11b-positivas, indicando monócitos que expressam Ly6C e neutrófilos que expressam Ly6G.

Excite as células com um laser azul; a emissão de fluorescência verde das células CD11b-positivas restantes confirma a captação microglial de partículas fluorescentes.

Três horas após a injeção intravítrea, use uma pinça de ângulo de 45 graus para pressionar suavemente contra a pálpebra para proptose o globo ocular. Posicione a pinça atrás do globo ocular e puxe. Em seguida, transfira o globo ocular para a área seca de uma placa de Petri contendo um pequeno volume de PBS com cálcio e magnésio sob um microscópio de dissecação e use uma ponta da pinça superfina para perfurar o olho no limbo da córnea. Em seguida, segurando o globo ocular com uma pinça fina em ângulo de 45 graus, use uma tesoura de mola para cortar ao redor do limbo da córnea até que cerca de metade da circunferência seja cortada.

Transfira o globo ocular para PBS e use um segundo par de pinças finas em ângulo de 45 graus para separar a córnea e a esclera. A lente e a retina sairão intactas. Certifique-se de que a lente e a retina estejam separadas e transfira a retina para um tubo de ensaio de poliestireno de 5,4 mililitros contendo 2 mililitros de PBS com cálcio e magnésio.

Para obter uma suspensão unicelular das células da retina, use um kit de dissociação do tecido neuronal de acordo com as instruções do fabricante e ressuspenda as células em 200 microlitros de tampão de coloração. Em seguida, transfira a amostra para um poço de uma placa de fundo em U de 96 poços. Após a centrifugação, inverta a placa para descartar o sobrenadante e bloqueie os receptores FC com 25 microlitros de tampão corante contendo anticorpo CD16/CD32 por poço por 5 minutos em temperatura ambiente. Em seguida, rotule as células com os anticorpos de interesse por 15 minutos em temperatura ambiente no escuro.

Em seguida, pelete as células e, em seguida, lave 200 microlitros de tampão de coloração fresco por poço. Agora, ressuspenda os pellets em 200 microlitros de tampão de manchas e corante de viabilidade e transfira as amostras para tubos de microtitulação de 1,2 mililitro. Em seguida, lave os poços com mais 100 microlitros de tampão de coloração e corante de viabilidade e agrupe as lavagens com as amostras correspondentes para análise por citometria de fluxo.