Usando sondas de tensão baseadas em DNA para avaliar as forças receptoras aplicadas pelas células imunes

Comece com uma lamínula de vidro funcionalizada com nanopartículas de ouro ancoradas em polietilenoglicol.

Adicione sondas de tensão de gancho de cabelo de DNA contendo um grampo de cabelo de DNA hibridizado com dois oligonucleotídeos em braços opostos.

A fita ligante inclui um fluoróforo e biotina, enquanto a fita âncora contém um sufre e um grupo tiol. Nesta configuração, o suprimir suprime a fluorescência.

As sondas de DNA se ligam às nanopartículas de ouro, ancorando-se na lamínula de vidro.

Introduzir estreptavidina, interagindo com as moléculas de biotina das fitas ligantes.

Adicione ligantes biotinilados que se ligam a moléculas de estreptavidina pré-ligadas.

Sobreponha a lamínula com células T CD8-positivas; seus receptores interagem com ligantes imobilizados, formando um local de interação receptor-ligante.

Essa interação gera uma força que desdobra a estrutura do grampo de DNA, separando o fluoróforo do supressor e promovendo a emissão de fluorescência.

Introduza fitas de travamento não fluorescentes que interagem com segmentos desdobrados das sondas para preservar o sinal de fluorescência.

Quantifique a fluorescência para avaliar as forças receptoras aplicadas pelas células imunes.

Para começar, coloque lamínulas de 25 milímetros em uma prateleira de politetrafluoretileno em um copo de 50 mililitros e enxágue as lamínulas três vezes submergindo-as em água. Misturar volumes iguais de etanol e água e adicionar 40 mililitros desta solução ao copo que contém a grelha e as lamínulas. Em seguida, feche o copo com fita adesiva.

Limpar as lamínulas sonicando o copo durante 15 minutos num produto de limpeza ultra-sónico e deitar fora o líquido após a sonicação. Em seguida, lave o copo que contém a grelha e as lamínulas com água, pelo menos, seis vezes para remover qualquer solvente orgânico restante. Para preparar uma solução fresca de piranha, adicione 30 mililitros de ácido sulfúrico a um copo de 50 mililitros e adicione lentamente 10 mililitros de peróxido de hidrogênio. Misture delicadamente a solução de piranha usando a ponta de uma pipeta de vidro.

Para iniciar a gravação, transfira o rack que contém as lamínulas para o béquer contendo a solução de piranha e incube por 30 minutos em temperatura ambiente para limpar e hidroxilar as lamínulas. Em seguida, transfira o rack usando uma pinça de aço ou politetrafluoretileno para um copo limpo de 50 mililitros e enxágue com água seis vezes. Para remover completamente a água, mergulhe o rack que contém as lamínulas em um béquer de 50 mililitros com 40 mililitros de etanol e, em seguida, descarte o etanol.

Em seguida, mergulhe o rack em 40 mililitros de etanol contendo 3% de aminopropiltrietoxisilano por 1 hora em temperatura ambiente para iniciar a reação com o grupo hidroxila nas lamínulas. Enxágue a superfície da lamínula seis vezes, submergindo-a em 40 mililitros de etanol e seque-a no forno a 80 graus Celsius por 20 minutos.

Cubra o fundo interno da placa de Petri com fita de parafilme para evitar que as lamínulas deslizem para dentro da placa de Petri. Em seguida, coloque as lamínulas cobertas de amina com o lado a ser funcionalizado com as sondas de tensão de DNA voltadas para cima. Cubra as lamínulas a menos 20 graus Celsius para uso futuro.

Para modificar os grupos amina nas lamínulas, adicione ácido lipóico-PEG-NHS e mPEG-NHS e incube a placa de Petri à temperatura ambiente por 1 hora. No final da incubação, enxágue a superfície três vezes com água. Depois disso, adicione 100 microlitros de bicarbonato de sódio 0,1 molar contendo 1 miligrama por mililitro de acetato de Sulfo-NHS a um conjunto de lamínulas sanduíche e incube por 30 minutos para que ocorra a passivação.

Adicione 0,5 mililitros de nanopartículas de ouro a cada lamínula e incube por 30 minutos em temperatura ambiente. Após a incubação, lave as lamínulas com água três vezes. Depois de adicionar o filtro de buraco negro 2 à sonda de tensão de DNA recozido na proporção de 10 para 1, adicione 100 microlitros da mistura por duas lamínulas para fazer o sanduíche.

Coloque cuidadosamente uma bola de tecido de laboratório úmida na placa de Petri, longe das lamínulas, e sele a placa com fita parafilme para evitar que a solução seque. Depois disso, cubra o prato com papel alumínio e incube-o a 4 graus Celsius durante a noite. No dia seguinte, monte a câmara de imagem tomando cuidado para evitar rachaduras na superfície enquanto aperta a câmara. Em seguida, adicione 0,5 a 1 mililitros da solução salina balanceada de Hank à câmara de imagem.

Use o canal Cy3B com uma objetiva de 100x para capturar sinais fluorescentes de células revestidas nas sondas de tensão do gancho de cabelo do DNA quando elas começarem a se espalhar. Depois de preparar o estoque de fita bloqueada não fluorescente de 100 micromolares, no ponto de tempo desejado, adicione-o às células em uma concentração final de 1 micromolar na câmara de imagem para armazenar o sinal de tensão e misture-o com as células por pipetagem.

Após cerca de 10 minutos de bloqueio, adquira filmes de lapso de tempo ou imagens de ponto final em epifluorescência para mapeamento qualitativo de tensão e análise quantitativa.