JoVE Encyclopedia of Experiments
Imunologia
0 vistas • 2:22 min • July 8th, 2025
Comece com uma placa de imagem à base de vidro contendo uma suspensão de neutrófilos humanos - ou células imunológicas e visualize-a sob um sistema de imagem de fluorescência.
Introduza conídios repórteres de Aspergillus fluorescentes geneticamente modificados - ou esporos de fungos, e capture imagens em intervalos regulares de até 6 horas.
Os esporos do fungo expressam proteínas fluorescentes vermelhas e são marcados externamente com fluoróforos magenta não degradáveis - ajudando a distinguir as células mortas das vivas.
Durante a incubação, os neutrófilos interagem com moléculas associadas a patógenos nos conídios por meio de receptores de reconhecimento de padrões, facilitando seu engolfamento dentro de um fagossomo.
Mais tarde, o fagossomo se funde com o lisossomo contendo enzima, formando um fagolisossomo.
Dentro do fagolisossomo, as espécies reativas de oxigênio e as enzimas degradam os conídios.
Durante a imagem de células vivas, no ponto de tempo inicial, a fluorescência vermelha e magenta intensa dentro do fagossomo dos neutrófilos indica a presença de conídios vivos.
Com o tempo, uma diminuição na fluorescência vermelha com a retenção da fluorescência magenta indica a degradação dos conídios, confirmando a atividade antifúngica dos neutrófilos.
Para visualizar DsRed e AlexaFlour 633 durante a microscopia, pré-aqueça um aquecedor de microscópio e ligue o microscópio e o computador. Em seguida, adicione 100 microlitros de 3 vezes 10 à suspensão de conídios FLARE de 6 por mililitro aos poços apropriados da placa de imagem. Registre a hora em que os conídios FLARE são adicionados.
Monte a placa de imagem na platina do microscópio. Em seguida, nas configurações de aquisição, defina a potência do laser para 10% e o tempo de exposição para um segundo e ajuste a sensibilidade da câmera para uma imagem nítida, mas não superexposta, de DsRed e AF 633 e configure uma lista de pontos de estágio. Inicialize a imagem quando todos os pontos estiverem em foco, os canais fluorescentes forem otimizados e o tempo e a duração do ciclo forem definidos.