Utilizando bicamadas lipídicas suportadas por grânulos para investigar a saída sináptica das células T

Pegue as bicamadas lipídicas suportadas por contas, ou BSLBs, esferas de sílica revestidas com bicamadas lipídicas conjugadas com complexos antigênicos peptídeo-MHC, moléculas de adesão e co-estimulatórias, atuando como células sintéticas apresentadoras de antígenos.

Incubar com células T.

Os TCRs se ligam a peptídeos antigênicos em BSLBs, que, juntamente com sinais co-estimulatórios, formam uma sinapse imune, ativando as células T.

Essa ligação desencadeia cascatas de sinalização intracelular, induzindo o rearranjo da actina e formando microclusters na sinapse contendo moléculas de adesão e sinalização.

As células T liberam vesículas trans-sinápticas enriquecidas em TCRs, moléculas co-estimulatórias e conteúdo de grânulos líticos na sinapse, ligando-se a BSLBs.

Resfrie gradualmente a co-cultura para separar BSLBs de células T.

Centrifugue e descarte o sobrenadante. Use um tampão contendo proteínas para bloquear os locais de ligação livres nas superfícies.

Centrifugue e trate BSLBs e células T com anticorpos conjugados com fluoróforo que se ligam a moléculas específicas de sinalização e co-estimulatórias.

Usando citometria de fluxo, analise os sinais de fluorescência de BSLBs e células T para quantificar a saída sináptica.

Ressuspender 500.000 BSLBs por poço em 200 microlitros de tampão HBS/HSA. Transfira 100 microlitros de BSLBs por poço para uma nova placa de 96 poços com fundo em U para fazer uma duplicata, de modo que a quantidade final de BSLB por poço seja de 250.000. Gire os BSLBs a 300 vezes g por dois minutos em temperatura ambiente. Descarte o sobrenadante e, em seguida, ressuspenda os BSLBs usando 100 microlitros de suspensão de células T. Misture delicadamente para evitar a formação de bolhas. Incube as coculturas por 90 minutos a 37 graus Celsius.

Proteja as células da luz e resfrie as co-culturas incubando-as primeiro em temperatura ambiente por um mínimo de 15 minutos. Centrifugar as coculturas à temperatura ambiente durante 5 minutos a 500 vezes g. Rejeitar o sobrenadante e ressuspender as coculturas em BSA-PBS a 2% isentos de iões de cálcio e magnésio à temperatura ambiente para bloqueio. Coloque as células no gelo por 45 minutos e proteja-as da luz.

Prepare a mistura principal de anticorpos usando BSA e PBS a 2% filtrados a 0,22 micrômetros gelados como tampão de coloração. Esta mixagem master fornecerá bloqueio extra. Gire as co-culturas a 500 vezes g por 5 minutos e 4 graus Celsius. Descarte os sobrenadantes e, em seguida, use uma pipeta multicanal para ressuspender as células na mistura master permanente contendo concentrações otimizadas de anticorpos.

Inclua células marcadas com isotipo e BSLBs, BSLBs fluorescentes e não fluorescentes e células e BSLBs coradas isoladamente. Misture delicadamente pipetando para cima e para baixo metade do volume. Incube por 30 minutos no gelo e proteja-os da luz. Lave as células e BSLBs duas vezes usando 2% de BSA-PBS gelado Gire-os a 500 vezes g por 5 minutos a 4 graus Celsius. Após a centrifugação, verificar as coculturas sedimentadas no fundo dos poços. Em seguida, ressuspenda as co-culturas lavadas em 100 microlitros de PBS e adquira imediatamente.