Um ensaio de inibição de crescimento diferido para avaliar o efeito de compostos antimicrobianos derivados de bactérias

Comece com uma placa de ágar contendo nutrientes e coloque uma gota de uma cultura noturna de bactérias primárias produtoras de inibidores no centro.

Deixe a cultura secar, garantindo o mínimo de disseminação de bactérias, e incube.

Bactérias individuais formam colônias distintas e secretam compostos antimicrobianos - moléculas inibidoras que se difundem através do ágar a uma certa distância.

Pulverize uma cultura diluída de uma cepa bacteriana concorrente uniformemente na superfície do ágar que contém colônias de bactérias primárias.

Durante a incubação, os compostos antimicrobianos interagem com as bactérias concorrentes e interrompem seus processos celulares essenciais.

Isso resulta na morte de bactérias concorrentes nessa área específica, causando um declínio significativo no crescimento bacteriano.

Na área sem compostos antimicrobianos, as bactérias concorrentes utilizam os nutrientes e formam colônias distintas.

Isso cria um padrão de crescimento diferencial com uma zona distinta de inibição. Determine o diâmetro desta zona e a clareza da zona para avaliar o efeito de compostos antimicrobianos derivados de bactérias.

Para preparar culturas bacterianas durante a noite, coloque as cepas concorrentes e inibidoras em uma placa de ágar BHI estéril e incube a 37 graus Celsius aerobicamente por aproximadamente 18 horas. Em um frasco universal de 28 mililitros, inocule 10 mililitros de caldo BHI estéril com uma única colônia da cepa bacteriana concorrente necessária.

Incube a cultura em um agitador orbital universal a 37 graus Celsius e 250 RPM durante a noite. No dia seguinte, certifique-se de que as placas de ágar estejam completamente secas, sem condensação na tampa, para evitar que a inoculação se espalhe na placa. Pipete 25 microlitros da cultura noturna no centro das placas de ágar, evitando pressionar completamente o êmbolo da pipeta para evitar bolhas de ar que borrifam a cultura no ágar.

Deixe a cultura secar em temperatura ambiente para limitar a propagação da cultura. Em seguida, incube as placas de ágar a 37 graus Celsius aeróbica durante a noite. Depois de cultivar uma cultura durante a noite enquanto trabalha sob um armário de segurança de nível 2 forrado com papel absorvente, use caldo BHI para diluir a cultura dez vezes para produzir aproximadamente 4 vezes 10 elevado à sexta UFC por mililitro. Em seguida, despeje a cultura diluída em um frasco vaporizador de perfume de plástico estéril.

Para realizar um ensaio de inibição de crescimento diferido, pulverize a cultura através de cada um dos frascos do vaporizador para garantir que a cultura seja carregada no mecanismo de pulverização antes da pulverização no ágar. A uma distância de aproximadamente 15 centímetros acima do ágar, pulverize aproximadamente 250 microlitros de cultura diluída em toda a superfície do ágar. Incube as placas a 37 graus Celsius aeróbica durante a noite.

Para interpretar a inibição de crescimento diferida, medir a zona de inibição de crescimento da estirpe concorrente pulverizada em milímetros, subtraindo o diâmetro do ponto central do produtor do inibidor. Por fim, registre a pontuação de clareza para zonas de inibição de acordo com o protocolo de texto.