Enciclopédia de Experimentos da JoVE
Imunologia
0 visualizações • 5:52 min. • July 8th, 2025
Pegue uma placa de vários poços revestida de gelatina contendo células de câncer cerebral humano aderidas que expressam CXCR4.
Substitua a mídia por um corante sensível ao cálcio. As esterases intracelulares clivam o corante em um produto impermeável à membrana que se liga aos íons de cálcio, exibindo maior fluorescência.
Remova o corante, lave e adicione tampão.
Coloque a placa em um leitor de microplacas de fluorescência com composto de interação CXCR4 e placas contendo quimiocina CXCL12.
Usando parâmetros automatizados definidos, injete concentrações crescentes de compostos em poços de teste, seguidas por uma concentração específica de CXCL12.
Em poços de controle sem o composto, o CXCL12 se liga ao CXCR4.
Essa ligação ativa uma cascata de sinalização, liberando íons de cálcio no citoplasma, onde se ligam ao corante, intensificando a fluorescência.
No entanto, em poços de teste, os compostos que interagem inibem a ligação de CXCL12 a CXCR4, afetando a mobilização de cálcio e causando uma diminuição de fluorescência dependente da dose, confirmando-os como antagonistas de CXCR4.
No dia da passagem celular, cubra cada poço de uma placa de poliestireno de paredes pretas de 96 poços com fundo transparente com 100 microlitros de solução de gelatina a 0,1% e incube as placas por duas horas em temperatura ambiente. Enquanto a gelatina está solidificando, use uma solução de tripsina-EDTA para levantar as células de interesse do fundo de seu frasco de cultura, ressuspendendo as células em meio de crescimento fresco em um tubo cônico de 50 mililitros depois de se separarem.
Após a contagem, recolher as células por centrifugação e ressuspender o sedimento em meio de crescimento fresco até uma concentração de 1 x10,5 células viáveis por mililitro. Quando as placas estiverem prontas, descarte qualquer excesso de solução de gelatina e seque as placas em um lenço de papel. Em seguida, lave os poços com 200 microlitros de PBS e substitua a lavagem por 200 microlitros de células por poço, para uma incubação noturna a 37 graus Celsius e 5% de dióxido de carbono.
Na manhã seguinte, bata no prato para descartar o meio de crescimento dos poços e seque o prato de cabeça para baixo em uma toalha de papel. Em seguida, rotule as células em cada poço com 100 microlitros de solução de corante de carregamento por poço e incube a placa por 45 minutos no escuro em temperatura ambiente. Enquanto as células estão incubando, adicione 75 microlitros de CXCL12 por poço à placa de quimiocina e 50 microlitros do composto de interesse a cada poço da placa composta.
Em seguida, ligue a unidade de resfriamento do leitor de placas de fluorescência, seguida pelo próprio leitor de placas. Depois de permitir que o sistema inicie alguns minutos, abra o software do leitor de placas. Para configurar o protocolo de ensaio, na guia Configurações, selecione Modo de leitura e o comprimento de onda de excitação e emissão apropriado para o corante de carregamento.
Selecione a guia "Misturar com fluido de transferência" para misturar automaticamente os compostos na placa composta. Na guia "Transferir fluido", defina 20 microlitros de cada poço da placa composta a ser transferida para a placa de medição e posicione as pontas da pipeta a 20 microlitros abaixo da superfície do líquido. Defina a velocidade de aspiração para 50 microlitros por segundo e a velocidade de distribuição para 25 microlitros por segundo e clique em "Ler com fluido de transferência".
Durante o primeiro intervalo, selecione 60 leituras com um tempo de intervalo de leitura de um segundo, com 10 leituras a serem registradas antes que os compostos sejam dispensados na placa de medição e 50 leituras a serem concluídas depois. Defina o segundo intervalo com o tempo de intervalo de leitura de 30 segundos e 18 leituras. Selecione três lavagens de ponta para o protocolo, definindo cada etapa de lavagem para incluir o fluido de lavagem apropriado, um ciclo de lavagem, uma velocidade de bomba rápida e cinco golpes por lavagem.
Use a função "Pause Pipettor" para incluir uma pausa do pipetador de 300 segundos e use a configuração "Misturar com fluido de transferência" para permitir a mistura automática da solução CXCL12 dentro da placa de quimiocina. Na guia "Transferir fluido" subsequente, defina 25 microlitros de cada poço da placa de quimiocina a ser transferida para a placa de medição e posicione as pontas 20 microlitros abaixo da superfície do líquido. Defina a velocidade de aspiração para 50 microlitros por segundo e a velocidade de distribuição para 25 microlitros por segundo.
Use o botão "Ler com Fluido de Transferência" para definir o primeiro intervalo para incluir 145 leituras com um tempo de intervalo de leitura de um segundo. Defina o segundo intervalo para um tempo de intervalo de leitura de seis segundos e 20 leituras. Selecione mais três ciclos de ponta de lavagem, clique em "Definir stage temperatura" e defina a temperatura do dispositivo para 37 graus Celsius.
No final da incubação do corante de carga, descarte o tampão da placa de medição e seque a placa em um lenço de laboratório. Lave as células com 150 microlitros por poço de tampão de ensaio, substituindo o tampão por 80 microlitros de tampão de ensaio após dois minutos. Coloque a placa de medição na posição de leitura, a placa composta na posição da fonte 2, a placa de quimiocina na posição da fonte 3 e uma caixa de pontas pretas na posição da fonte 1.
Feche o dispositivo e clique em "Teste de sinal de protocolo" para determinar as unidades de luz relativas de fundo e as variantes de fluorescência sobre a placa. Selecione Testar "Sinal" na janela pop-up. Se forem obtidos valores de fundo de 8.000 a 10.000 unidades de luz relativa, selecione "Atualizar" e clique em "Salvar" para salvar o protocolo principal.