Um ensaio celular para a identificação de agentes que interagem com CXCR4

Pegue uma placa de vários poços revestida de gelatina contendo células de câncer cerebral humano aderidas que expressam CXCR4.

Substitua a mídia por um corante sensível ao cálcio. As esterases intracelulares clivam o corante em um produto impermeável à membrana que se liga aos íons de cálcio, exibindo maior fluorescência.

Remova o corante, lave e adicione tampão.

Coloque a placa em um leitor de microplacas de fluorescência com composto de interação CXCR4 e placas contendo quimiocina CXCL12.

Usando parâmetros automatizados definidos, injete concentrações crescentes de compostos em poços de teste, seguidas por uma concentração específica de CXCL12.

Em poços de controle sem o composto, o CXCL12 se liga ao CXCR4.

Essa ligação ativa uma cascata de sinalização, liberando íons de cálcio no citoplasma, onde se ligam ao corante, intensificando a fluorescência.

No entanto, em poços de teste, os compostos que interagem inibem a ligação de CXCL12 a CXCR4, afetando a mobilização de cálcio e causando uma diminuição de fluorescência dependente da dose, confirmando-os como antagonistas de CXCR4.

No dia da passagem celular, cubra cada poço de uma placa de poliestireno de paredes pretas de 96 poços