Um ensaio de fixação viral para triagem de compostos antivirais

Comece com uma placa de vários poços contendo uma monocamada de células de hepatoma humano pré-resfriada.

Tratar os alvéolos de teste com uma mistura do vírus da hepatite C geneticamente modificado que transporta o gene da luciferase e um composto-alvo; tratar os alvéolos de controlo apenas com o vírus.

Nos poços de teste, as moléculas-alvo interagem com glicoproteínas virais e receptores de superfície celular, impedindo a ligação viral.

No entanto, em poços de controle, as glicoproteínas virais interagem com os receptores da superfície celular, permitindo sua ligação. Uma temperatura baixa inibe a entrada viral.

Remova o sobrenadante, introduza um meio e reincube na temperatura ideal, facilitando a entrada viral.

Ao entrar, o vírus libera o material genético, iniciando a síntese de proteínas virais e enzimas luciferase, que são secretadas no meio.

Transfira o sobrenadante contendo luciferase e introduza um substrato.

A interação enzima-substrato produz luz proporcional aos níveis de luciferase.

A menor intensidade de luz nos poços de teste, em comparação com os poços de controle, indica a propriedade antiviral do composto alvo.

Para o ensaio de fixação viral, coloque 1 x 10⁴ células por poço em uma placa de 96 poços e incube durante a noite para fixação celular. Na manhã seguinte, primeiro, resfrie a placa de 96 poços contendo a monocamada de células a 4 graus Celsius por 1 hora.

Preparar os compostos de ensaio e a mistura de vírus no gelo. Por exemplo, HCV-CHLA, HCV - 1% DMSO ou soluções de HCV-heparina de controle positivo com 10² vírus FFU para cada poço de tratamento. Aspirar suavemente o meio dos poços de cultura de células. Em seguida, adicione imediatamente 100 microlitros de mistura de composto de teste de vírus em poços triplicados, tomando cuidado para não aumentar a temperatura. Incube a placa em uma geladeira mantida a 4 graus Celsius por três horas.

As partículas do vírus se fixam na superfície da célula a 4 graus Celsius, mas não são internalizadas. Em seguida, aspire os sobrenadantes. Lave suavemente as células duas vezes com 200 microlitros de PBS gelado. Adicione 100 microlitros de meio basal a cada poço e, em seguida, incube a 37 graus Celsius por 72 horas. Finalmente, para quantificar o repórter de luciferase liberado das células infectadas, colete o sobrenadante de cada poço de amostra e realize o ensaio de luciferase Gaussia.