Um ensaio para avaliar o efeito dos compostos de teste na entrada e fusão viral em células hospedeiras

Pegue células cancerígenas do fígado e incube em baixa temperatura para prejudicar a endocitose.

Introduzir um vírus recombinante da hepatite C ou HCV, compreendendo um genoma de RNA projetado que codifica um repórter de luciferase secretado.

As lipoproteínas virais interagem com os proteoglicanos nas células hospedeiras, enquanto as glicoproteínas do envelope viral se ligam a receptores específicos do hospedeiro.

Em poços selecionados, adicione o composto de teste que se liga às glicoproteínas virais.

Após a incubação à temperatura fisiológica, os vírus ligados são endocitados.

Descarte os vírus não internalizados, adicione um meio de crescimento e incuba.

Nos poços não tratados, as glicoproteínas auxiliam na fusão envelope-endossomo viral, liberando o nucleocapsídeo, enquanto o mascaramento composto prejudica a fusão nos poços tratados.

Após a liberação, o RNA expressa proteínas virais, incluindo a luciferase, que é secretada extracelularmente.

Colha o sobrenadante contendo luciferase e adicione um substrato bioluminescente, que é oxidado pela luciferase para emitir luz.

Uma diminuição da luminescência nos poços tratados em comparação com os não tratados indica inibição da fusão envelope-endossomo viral.

Para testar a fusão e entrada viral, pré-resfrie a placa de cultura de células a 4 graus Celsius por uma hora após a incubação noturna para fixação celular. Remova o meio existente dos poços e infecte as células com 10 elevado ao segundo FFU HCV no gelo.

Incube a placa a 4 graus Celsius por três horas. Lave suavemente as células duas vezes com 200 microlitros de PBS gelado para remover o vírus não aderido. Em seguida, no gelo, trate as células com um composto de teste dissolvido em meio basal ou meio basal com 1% de DMSO como controle e incube a placa a 37 graus Celsius por três horas. Isso permite a avaliação dos compostos de teste na entrada viral, que ocorre a 37 graus Celsius.

Aspire o meio e lave os vírus não internalizados duas vezes com 200 microlitros de tampão citrato ou PBS. Adicione 100 microlitros de meio basal por poço e incube a 37 graus Celsius por mais 72 horas. Colete o sobrenadante e execute o ensaio de luciferase Gaussia conforme demonstrado anteriormente para detectar o repórter de luciferase liberado.