Enciclopédia de Experimentos da JoVE
Imunologia
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Comece com um DNAzyme de clivagem de RNA, um DNA catalítico que, ao se ligar a um biomarcador bacteriano específico, é ativado.
O DNAzyme está ligado a um grânulo magnético revestido de estreptavidina via biotina em sua extremidade 5 '. Na extremidade 3', ele está ligado a uma urease ligada a oligonucleotídeos, formando um grânulo magnético funcional.
A um tubo contendo esferas magnéticas funcionais, adicione um lisado de E. coli.
Um biomarcador específico de E. coli do lisado ativa o DNAzyme, desencadeando a clivagem da ligação do RNA, causando o descolamento do conjugado DNAzyme-urease.
Use um suporte magnético para imobilizar as esferas e remover o conjugado DNAzyme-urease ligado a contas.
Transfira o sobrenadante contendo urease liberado para outro tubo.
Adicione um corante indicador de pH - vermelho de fenol e uma solução de ureia.
A urease hidrolisa a uréia em amônia e dióxido de carbono.
A amônia, uma base fraca, eleva o pH da solução, causando uma mudança de cor, que indica a presença do biomarcador E. coli.
Depois de preparar as células de E. coli de acordo com o protocolo de texto, pré-lave um tubo de microcentrífuga de 1,5 mililitro adicionando e vortando 100 microlitros de RB. Em seguida, descarte o buffer.
Adicione 15 microlitros de EC1 montado ao tubo lavado, em seguida, coloque o tubo no rack magnético e aspire o sobrenadante. Remova o tubo do rack, adicione 100 microlitros de RB e ressuspenda cuidadosamente as esferas magnéticas.
Depois de usar RB para lavar as esferas mais duas vezes e remover o RB, adicione 10 microlitros da amostra de E. coli ao tubo e misture suavemente o conteúdo batendo no tubo. Em seguida, incube a reação em temperatura ambiente por uma hora.
Após a incubação, adicione 90 microlitros de água bidestilada e coloque o tubo no suporte magnético. Após aproximadamente três minutos de separação magnética, transfira cuidadosamente 85 microlitros do sobrenadante para um tubo de microcentrífuga de 0,5 mililitro.
É muito importante pipetar a solução com cuidado, sem pegar nenhuma das esferas magnéticas. Essas esferas são carregadas com urease e geram um sinal falso positivo.
Adicione 15 microlitros de vermelho de fenol a 0,04% e 100 microlitros de solução de substrato. Em seguida, tire fotos em intervalos de tempo específicos para registrar uma mudança de cor.