Enciclopédia de Experimentos da JoVE
Imunologia
0 visualizações • 4:07 min. • July 8th, 2025
Pegue os complexos de transfecção que compreendem mRNAs repórteres que codificam para a luciferase do vaga-lume, ou Fluc, e a luciferase de Renilla, ou Rluc.
O mRNA Fluc contém uma sequência de poliadenosina 5', ou um líder poli(A), enquanto o mRNA Rluc não possui essa sequência.
Transfectar células de mamíferos não infectadas e infectadas por poxvírus para entregar mRNAs ao repórter e incubar.
Em células não infectadas, os fatores de iniciação eucarióticos se ligam à tampa 5' do mRNA, seguidos pelo recrutamento da pequena subunidade ribossômica e um tRNA iniciador.
Após a pequena subunidade localizar o códon inicial, a grande subunidade se une para sintetizar proteínas de luciferase.
Em células infectadas, a fosforilação mediada por poxvírus da pequena subunidade causa a montagem do ribossomo diretamente na sequência líder, aumentando a produção de Fluc.
Lise as células para liberar as luciferases.
Adicione o substrato Fluc, que a enzima oxida, emitindo luz. Usando um leitor de placas, meça a luminescência.
Repita a etapa de Rluc para determinar o aumento relativo na luminescência de Fluc em comparação com Rluc em células infectadas por vírus.
Semeie células HeLa em uma placa de 2
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