Um método de placa de microtitulação para avaliar a concentração inibitória mínima de um antibiótico

Tome placas de microtitulação contendo um antibiótico aminoglicosídeo diluído em série. Uma das placas contém NTBC, uma droga sintética.

Introduza Pseudomonas aeruginosa, uma bactéria gram-negativa, e incuba.

A bactéria produz piomelanina - um pigmento extracelular protetor - nos poços não tratados com NTBC, enquanto a droga impede a produção de piomelanina.

O antibiótico catiônico se liga a lipopolissacarídeos aniônicos, ou LPS, na membrana externa bacteriana, deslocando as pontes catiônicas e desestabilizando a membrana.

Ao entrar na bactéria, o antibiótico se liga ao sítio aminoacil, ou sítio A, na subunidade ribossômica 30S.

O antibiótico ligado impede a ligação do aminoacil-tRNA e o movimento ribossômico através do mRNA, interferindo na síntese de proteínas e inibindo o crescimento bacteriano.

Após a incubação, meça a densidade óptica da cultura para avaliar o crescimento bacteriano.

A menor concentração de antibiótico que impede o crescimento bacteriano é a concentração inibitória mínima ou CIM.

Valores semelhantes de CIM para poços tratados com NTBC e não tratados com NTBC não indicam nenhum impacto do NTBC na sensibilidade antibiótica das bactérias.

Um dia antes do ensaio de CIM, preparar culturas das estirpes a testar em LB com e sem 2-[2-nitro-4-trifluorometil)benzoil]-1-3 ciclohexanodiona ou NTBC. Esta demonstração usa o nível representativo de 300 micromolares de NTBC. O método de titulação para determinar a concentração apropriada de NTBC é descrito no texto do protocolo. Incubar as culturas durante a noite a 37 graus Celsius com aeração. No dia seguinte, faça as soluções mestre LB mais NTBC e LB mais DMSO para o ensaio MIC.

Para testar um antibiótico para uma cepa, adicione 600 micromolares de NTBC a 2 mililitros de LB e misture para fazer a solução mestre de NTBC. O NTBC é adicionado a uma concentração de 600 micromolares porque será diluído duas vezes quando o inóculo for adicionado, resultando em uma concentração final de 300 micromolares. Adicione um volume equivalente do DMSO do veículo a 2 mililitros de LB e misture para fazer a solução mestre sem NTBC. Essas duas soluções principais serão usadas para criar soluções de estoque de antibióticos, bem como para configurar a série de diluição em placas de 96 poços.

Em seguida, prepare as soluções antibióticas nas soluções mestre LB mais NTBC ou LB mais DMSO. Preparar a gentamicina mais ou menos a solução-mãe de NTBC a 64 microgramas por mililitro. Fazer a canamicina mais ou menos a solução-mãe NTBC a 256 microgramas por mililitro. Preparar a tobramicina associada ou negativa à solução-mãe NTBC a 8 microgramas por mililitro.

Depois que as soluções antibióticas 2X forem feitas, adicione 100 microlitros de cada solução antibiótica a quatro poços em uma placa de 96 poços na linha A. Por exemplo, a gentamicina deve ser colocada em A1 a A4. A canamicina deve ser colocada em A5 a A8 e a tobramicina deve ser colocada em A9 a A12.

Adicione 50 microlitros da solução mestre LB mais NTBC ou LB mais DMSO às linhas B a H da placa de 96 poços. Certifique-se de que uma placa seja LB mais NTBC e uma placa seja LB mais DMSO. Usando um cabeçalho de micropipeta, execute diluições seriadas duplas dos antibióticos transferindo 50 microlitros da solução da linha A para a linha B. Misture a solução, troque as pontas da pipeta e transfira 50 microlitros da solução da linha B para a linha C. Repita para as linhas restantes.

Depois de diluir a linha G, remova 50 microlitros da solução dessa linha e descarte. Use a linha H como um controle sem antibióticos para o crescimento bacteriano. Recupere as culturas da noite para o dia. Após lavar todas as culturas para eliminar a biomelanina presente no meio, meça o OD₆₀₀ das culturas. Diluir as culturas durante a noite em LB.

Usando uma micropipeta multicanal, adicione 50 microlitros da cultura bacteriana diluída aos poços apropriados. Adicione bactérias a três poços para cada cepa e concentração de antibiótico. Adicione 50 microlitros de LB ao quarto poço para atuar como controle da contaminação bacteriana. Cubra as placas de 96 poços com parafilme e incube por aproximadamente 24 horas a 37 graus Celsius.

No dia seguinte, examine visualmente as placas quanto ao crescimento bacteriano nos poços. A CIM é a concentração mais baixa de antibiótico em que não se observa crescimento bacteriano para as três repetições de cada estirpe.