JoVE Encyclopedia of Experiments
Imunologia
0 vistas • 4:10 min • July 8th, 2025
Pegue poços contendo hidrogéis de poliacrilamida de rigidez variável revestidos com colágeno, imitando uma matriz extracelular fisiológica, ou ECM.
Adicione células endoteliais microvasculares que formam aderências focais, ou FAs - complexos que medeiam a ligação célula-ECM - para sentir a rigidez do hidrogel.
Hidrogéis mais rígidos elevam a expressão de vimentina na superfície celular, um componente do citoesqueleto, em comparação com hidrogéis mais macios.
Adicione a bactéria Listeria monocytogenes, projetada para expressar uma proteína fluorescente sob o promotor da proteína indutora de montagem de actina, ou ActA.
Centrifugue para sincronizar o contato bacteriano com as células hospedeiras e incuba.
A bactéria se liga à vimentina. Mais vimentina nas células hospedeiras mais rígidas ligadas ao hidrogel leva a mais adesão bacteriana e endocitose.
Adicione um antibiótico, eliminando bactérias não internalizadas.
As bactérias internalizadas secretam toxinas, rompendo a membrana do endossomo. O escape citoplasmático ativa o promotor ActA para expressar a proteína fluorescente, marcando bactérias intracelulares.
Separar enzimaticamente as células. Usando citometria de fluxo, detecte uma fluorescência mais alta nas células hospedeiras que residem em hidrogéis mais rígidos, indicando maior internalização bacteriana.
Depois de preparar uma cultura noturna de L. monocytogenes de acordo com o protocolo de texto, transfira 1 mililitro da cultura para um tubo de microcentrífuga e gire-o a 2.000 vezes g e temperatura ambiente por 4 minutos. Depois de usar PBS de grau de cultura de tecidos para lavar o pellet duas vezes, use 1 mililitro de PBS para ressuspender o pellet.
Prepare a mistura de infecção combinando 10 ou 50 microlitros da suspensão bacteriana com 1 mililitro de meio completo MCDB-131 para uma multiplicidade de infecção, ou MOI, de aproximadamente 50 bactérias por célula hospedeira ou 10 bactérias por célula hospedeira. Remova o meio dos poços das placas de 24 poços, tomando cuidado para não romper os hidrogéis ou as células. Use 1 mililitro de meio MCDB-131 completo para lavar as células uma vez e, em seguida, adicione 1 mililitro da bactéria a cada poço.
Coloque a tampa nos pratos e embrulhe-os com filme plástico de polietileno para evitar vazamentos. Centrifugue as placas a 2.000 vezes g por 10 minutos para sincronizar a invasão. Em seguida, incube as culturas a 37 graus Celsius por 30 minutos. Com o meio completo MCDB-131, lave as amostras 4 vezes e devolva-as à incubadora de cultura de tecidos. Após mais 30 minutos, substitua o meio por meio MCDB-131 completo suplementado com 20 microgramas por mililitro de gentamicina.
Para realizar a citometria de fluxo oito horas após a infecção, remova o meio dos poços da placa de 24 poços e use PBS de cultura de tecidos para lavar os poços uma vez. Após a remoção do PBS, adicione 200 microlitros de mistura de tripsina-EDTA-colagenase a cada poço. Coloque o prato na incubadora de cultura de tecidos por 10 minutos para permitir o descolamento total das células.
Depois de pipetar suavemente cada poço oito vezes, adicione 200 microlitros de meio completo para neutralizar a tripsina. Transfira os 400 microlitros de solução celular de cada poço para um tubo de poliestireno de 5 mililitros com uma tampa de filtro de célula de 35 micrômetros. Analise as amostras por citometria de fluxo.