Microscopia quantitativa de lapso de tempo para avaliação da disseminação bacteriana dependente da rigidez da matriz extracelular

Pegue uma placa de vários poços com monocamadas de células endoteliais humanas aderentes em hidrogéis de poliacrilamida revestidos com colágeno de rigidez variável.

As células em hidrogéis mais rígidos sofrem reorganização significativa do citoesqueleto, aumentando a tensão intracelular, em comparação com hidrogéis mais macios.

Lave as células com meio e adicione Listeria monocytogenes modificada - expressando uma proteína fluorescente sob o promotor da proteína indutora de montagem de actina (ActA).

Centrífuga para facilitar o contato célula-bactéria. Incubar para mediar a endocitose bacteriana.

Lave com mídia. Trate com gentamicina para eliminar bactérias não internalizadas. Incubar.

As bactérias internalizadas liberam toxinas formadoras de poros, rompendo as membranas fagossômicas. As bactérias citosólicas regulam positivamente a expressão de ActA e proteínas fluorescentes, marcando bactérias intracelulares.

As proteínas ActA induzem a polimerização da actina, formando uma cauda de cometa de actina impulsionando as bactérias para frente, causando internalização por células vizinhas e promovendo a disseminação.

Após a incubação, use meios contendo corante para corar os núcleos das células. Substitua a mídia por mídia que contenha gentamicina.

Realize microscopia de lapso de tempo.

Hidrogéis mais macios promovem rápida disseminação intercelular de bactérias em comparação com hidrogéis mais rígidos com aumento da tensão intracelular, sugerindo disseminação bacteriana dependente da rigidez da matriz.

Depois de preparar uma cultura noturna de L. monocytogenes de acordo com o protocolo de texto, transfira 1 mililitro da cultura para um tubo de microcentrífuga e gire-o a 2.000 vezes g e temperatura ambiente por 4 minutos. Depois de usar PBS de grau de cultura de tecidos para lavar o pellet duas vezes, use 1 mililitro de PBS para ressuspender o pellet.

Prepare a mistura de infecção combinando 10 ou 50 microlitros da suspensão bacteriana com 1 mililitro de meio completo MCDB-131 para uma multiplicidade de infecção, ou MOI, de aproximadamente 50 bactérias por célula hospedeira ou 10 bactérias por célula hospedeira. Remova o meio dos poços das placas de 24 poços, tomando cuidado para não romper os hidrogéis ou as células.

Use 1 mililitro de MCDB-131 meio completo para lavar as células uma vez e, em seguida, adicione 1 mililitro da bactéria a cada poço. Coloque a tampa nos pratos e embrulhe-os com filme plástico de polietileno para evitar vazamentos. Centrifugue as placas a 2.000 x g por 10 minutos para sincronizar a invasão. Em seguida, incube as culturas a 37 graus Celsius por 30 minutos. Com o meio completo MCDB-131, lave as amostras 4 vezes e devolva-as à incubadora de cultura de tecidos. Após mais 30 minutos, substitua o meio por meio MCDB-131 completo suplementado com 20 microgramas por mililitro de gentamicina.

Depois de semear células HMEC-1 em hidrogéis de PA e tratar com gentamicina de acordo com o protocolo de texto, incube a placa por cinco horas para permitir que o promotor ActA ligue e conduza a expressão do quadro de leitura aberto mTagRFP.

Quatro horas após a infecção, misture 1 microlitro de corante Hoechst 1mg/ml com 1 mililitro de meio completo L15 e adicione-o a cada poço para corar os núcleos. Após incubar as células durante 10 minutos, substituir o meio por 1 mililitro de meio L15 completo suplementado com 20 microgramas por mililitro de gentamicina.

Crie imagens de várias posições a cada 5 minutos usando um recurso de foco automático para monitorar como as bactérias LM se espalham através de monocamadas HMEC-1 semeadas em hidrogéis de rigidez variável.