Determinando a eficácia antiviral de drogas experimentais por meio de um ensaio de placa

Comece com uma amostra contendo vírus obtida de uma córnea suína infectada tratada com um medicamento antiviral.

Efectuar uma diluição em série da amostra para criar uma sequência de concentrações decrescentes de vírus.

A diluição ideal evita a infecção de uma única célula por vários vírus.

Introduzir as amostras diluídas numa monocamada de células hospedeiras e incubar.

O vírus se liga ao receptor da célula hospedeira, entra na célula e inicia sua replicação. A célula infectada lisa, liberando vírions.

Adicione metilcelulose, uma substância viscosa que confina os vírus às células próximas.

Posteriormente, os vírus causam morte celular e formação de placas na região infectada.

Adicione metanol para fixar as células.

Use cristal violeta para corar as células vivas.

Observe as placas como zonas claras indicando células infectadas e morte celular, cercadas por células não infectadas coradas com cristal violeta.

Finalmente, conte o número de placas na diluição mais alta para quantificar o título do vírus na solução inicial para determinar a eficácia do medicamento antiviral.

Para quantificar a quantidade de vírus coletada de cada córnea, prepare uma diluição de log₁₀ de uma dobra do vírus em meio livre de soro em tubos de microcentrífuga até que uma diluição de 1 x ^10-8 seja alcançada.

Depois de aspirar o meio de crescimento de cada poço de células, transferir 1 mililitro de cada diluição do vírus, começando em 1 x ^10-3 para as monocamadas de células plaqueadas, e colocar as células infectadas na incubadora de cultura de células por duas horas. No final da incubação, lave suavemente cada poço 2 vezes com PBS antes de adicionar 2 mililitros de meio carregado de metilcelulose a cada poço para uma incubação de 72 horas ou até que a formação de placas possa ser observada.

Após a observação da placa, adicione lentamente 1 mililitro de metanol ao canto de cada poço para uma incubação de 15 minutos em temperatura ambiente. No final da incubação, aspirar lentamente o conteúdo de cada poço sem perturbar a monocamada celular.

Em seguida, rotule cada poço com 1 mililitro de solução de trabalho de cristal violeta, cuidando para que todas as células fiquem cobertas por uma incubação de 30 minutos protegida da luz. No final da incubação, descarte a solução e seque os poços em uma folha de papel absorvente. Em seguida, conte o número de placas no poço de diluição mais alta para quantificar o conteúdo total de vírus na solução inicial 3 vezes.