Um ensaio para determinar a iniciação do biofilme polimicrobiano em células infectadas por vírus

Pegue uma placa de vários poços contendo monocamadas de células de mamíferos.

Poços de teste de sementes com o vírus Herpes simplex. Os poços de controle não têm o vírus.

O vírus se liga ao sulfato de heparano da superfície celular e é internalizado por endocitose.

A infecção por vírus desencadeia a secreção de heparanase, que cliva o sulfato de heparano e desmascara receptores fúngicos específicos.

Co-incubar as células com tubos germinativos de Staphylococcus aureus e Candida albicans.

Em células infectadas por vírus, a depleção de sulfato de heparano inibe a interação bacteriana enquanto promove interações com receptores fúngicos, impedindo a co-localização bacteriano-fúngica.

Nas células de controle, as bactérias interagem com o sulfato de heparano, enquanto os fungos se ligam aos receptores disponíveis.

Essa co-localização microbiana inicia a adesão - o primeiro passo na formação do biofilme.

Pós-incubação, remova micróbios não ligados. Cubra com um tampão de lise, liberando bactérias e fungos no meio.

Espalhe o lisado celular em placas contendo meios de crescimento. Incubar para formação de colônias.

Uma diminuição nas colônias bacterianas com um aumento correspondente nas colônias fúngicas indica inibição induzida por vírus da co-localização bacteriano-fúngica e iniciação do biofilme.

Para realizar um ensaio de biofilme polimicrobiano, semeie placas de 96 poços com 200 microlitros de 2 vezes 10 elevado à 5ª célula HeLa por mililitro. Balance as placas a 37 graus Celsius por 30 a 45 minutos, antes de incubar em 5% de dióxido de carbono a 37 graus Celsius por 18 horas. Use 1x optimum para lavar as monocamadas. Em seguida, semeie com uma única cepa de HSV. Teste apenas uma cepa de cada vez.

Incube as placas a 37 graus Celsius em 5% de dióxido de carbono por três horas. Usando 100 microlitros de PBS de 37 graus Celsius com magnésio e cálcio, lave as monocamadas infectadas. Em seguida, use HBSS de 37 graus Celsius para substituir o PBS. Deixe 25 microlitros do HBSS em cada poço.

Em seguida, adicione suspensões de trabalho GT e / ou S. aureus e incube as placas a 37 graus Celsius em 5% de dióxido de carbono por 30 minutos. Após a incubação, aspire uma coluna da placa de cada vez. Reabasteça imediatamente os poços usando 300 microlitros de PBS com magnésio e cálcio.

Depois de repetir esta etapa de lavagem duas vezes, adicione 200 microlitros em uma diluição de 1 a 50 de tampão de lise RIPA esterilizado por filtro a cada poço.

Ao trabalhar com outras cepas de bactérias ou fungos, certifique-se de que a concentração de RIPA usada seja suficiente para a lise celular, mas ainda permissiva para testes de viabilidade microbiana.

Triturar rapidamente o lisado de células HeLa e pipetar 50 microlitros em sais de manitol e/ou meio fungicida. Em seguida, usando uma haste de vidro dobrada em um ângulo de 90 graus, espalhe o lisado sobre a superfície da placa.

Depois de incubar as placas por 18 horas, conte manualmente o número de colônias por placa. Os controles consistem na adesão de S. aureus e/ou C. albicans às células HeLa não infectadas por HSV.