Enciclopédia de Experimentos da JoVE
Imunologia
0 visualizações • 2:56 min. • July 8th, 2025
Comece semeando uma cultura bacteriana em uma placa de ensaio. Em seguida, incube a placa.
As células bacterianas possuem adesinas e pili superficiais que lhes permitem aderir umas às outras, formando pequenos agregados.
Adicione concentrações variadas de antibióticos aos poços, deixando um sem tratamento para controle.
As moléculas de antibióticos interagem com bactérias sensíveis, afetando sua capacidade de crescer e se reproduzir, levando à sua morte.
As bactérias resistentes a antibióticos permanecem metabolicamente ativas, produzindo moléculas de ATP.
Use um sonicador para interromper as células bacterianas, liberando seu conteúdo intracelular, incluindo ATP.
Adicione o reagente luminoso de utilização de ATP contendo luciferina, enzima luciferase e outros cofatores.
A luciferase utiliza ATP e oxigênio para converter a luciferina em uma oxiluciferina excitada.
A oxiluciferina subsequentemente faz a transição para seu estado fundamental, emitindo luz luminescente.
Meça a absorbância usando um leitor de placas.
A diminuição da absorbância em concentrações mais altas de antibióticos sugere menor produção de ATP, indicando uma taxa de sobrevivência bacteriana reduzida.
Meça a densidade óptica em 650 nanômetros ou OD650 para determinar a concentração das bactérias suspensas e ajuste a concentração de GC para cerca de 1 x 108 unidades formadoras de colônias por mililitro. Em seguida, adicione 99 microlitros da suspensão de GC em poços individuais de uma placa de 96 poços e permita que as bactérias se agreguem a 37 graus Celsius e 5% de dióxido de carbono por 6 horas.
No final da incubação, adicione 1 microlitro de ceftriaxona diluída em série a cada poço, deixando alguns poços sem tratamento para servir como controles, e retorne a placa à incubadora por mais 24 horas. No dia seguinte, sonicar a suspensão em cada poço três vezes a 144 watts e 20 kilohertz por 5 segundos por sonicação e adicionar 100 microlitros de reagente luminoso de utilização de ATP disponível comercialmente a cada poço.
Transfira cuidadosamente 150 microlitros de mistura de cada poço para poços individuais de uma nova microplaca preta de 96 poços e meça a absorbância de cada poço em 560 nanômetros em um leitor de placas. Em seguida, calcule a taxa de sobrevivência pela razão entre a leitura obtida após o tratamento com antibióticos seriados e a leitura dos poços não tratados.