Enciclopédia de Experimentos da JoVE
Imunologia
0 visualizações • 4:23 min. • July 8th, 2025
Pegue uma placa de vários poços contendo monoculturas esferóides 3D de células de linfoma, glóbulos brancos cancerígenos e co-culturas de linfoma e células semelhantes a neutrófilos em uma matriz de membrana basal.
Adicione um medicamento de teste que se ligue à tubulina intracelular e interrompa a polimerização dos microtúbulos, resultando em apoptose celular.
Na co-cultura, o contato direto com células do linfoma ativa as células semelhantes a neutrófilos, induzindo a secreção de citocinas.
Essas citocinas interagem com os receptores das células do linfoma, desencadeando cascatas de sinalização a jusante e regulando positivamente a expressão de proteínas antiapoptóticas, promovendo a sobrevivência celular.
Descarte a mídia. Adicione um tampão de dissociação para interromper a adesão celular.
Raspe os esferóides e incube-os sob agitação. Transfira a suspensão para tubos e continue a agitação para formar suspensões unicelulares.
Introduza um coquetel de anticorpos conjugado com fluoróforo que rotula linfoma e células semelhantes a neutrófilos.
Adicione anexina V marcada com fluoróforo e iodeto de propídio para marcar células apoptóticas e mortas.
Usando citometria de fluxo, detecte aumento da sobrevivência das células do linfoma na cocultura, indicando proteção mediada por neutrófilos contra a droga.
Para configurar uma co-cultura 3D, adicione 50.000 células B de linfoma RL sozinhas ou misture com células diferenciadas por HL60 em tubos estéreis de 15 mililitros.
Gire as amostras e ressuspenda os pellets em 300 microlitros de matriz de membrana basal usando uma ponta de pipeta de 1 mililitro com a abertura cortada em 2 a 3 milímetros. Em seguida, incube 300 microlitros de células em cada poço de uma placa de 24 poços por 30 minutos a 37 graus Celsius e 5% de CO2.
No final da incubação, adicione 1 mililitro de meio RPMI completo a cada poço e retorne às culturas 3D para a incubadora por mais sete dias com trocas de meio a cada dois dias. No dia 5, adicione 10 vincristina nanomolar às culturas.
Após uma semana de cultura, aspire o meio e lave cada poço 2 vezes com 1 mililitro de PBS gelado. Em seguida, adicione 3 mililitros de PBS gelado com EDTA a cada poço e raspe o fundo dos poços com uma ponta de pipeta de 200 microlitros para destacar os géis. Agite o prato suavemente no gelo por 30 minutos. Em seguida, transfira as suspensões celulares para tubos individuais estéreis de 15 mililitros para agitar suavemente no gelo por mais 30 minutos.
Confirmar o aparecimento de uma suspensão celular homogénea. Em seguida, gire as células, seguidas de uma lavagem de PBS e ressuspenda os pellets em PBS fresco com FBS. Finalmente, rotule as células com os anticorpos apropriados e corantes de viabilidade como acabamos de demonstrar e analise as células diferenciadas por RL e HL60 por citometria de fluxo usando a estratégia de gating ilustrada.