Uma investigação de fluxo in vitro do efeito das células estromais no recrutamento de leucócitos

Pegue câmaras de fluxo pré-montadas conectadas a sistemas de fluxo com filtros transwell: uma com uma monocultura endotelial na parte superior e outra com uma cultura endotelial na parte superior e células estromais na parte inferior.

Ambas as câmaras são pré-tratadas com uma citocina pró-inflamatória.

Em uma monocultura, as citocinas ativam as células endoteliais, regulando positivamente a expressão da molécula de adesão.

No entanto, a conversa cruzada entre células estromais e endoteliais na co-cultura leva as células estromais a produzir mediadores reguladores que regulam negativamente a resposta das células endoteliais às citocinas pró-inflamatórias.

Posicione a câmara em um microscópio de contraste de fase invertido.

Introduza uma suspensão de neutrófilos.

Os neutrófilos são recrutados e se ligam às moléculas de adesão endotelial por meio de interações adesivas transitórias, facilitando sua interação com quimiocinas ligadas à superfície e rolando ao longo do endotélio.

Essa interação ativa as integrinas nos neutrófilos, estabilizando a adesão e resultando na transmigração através das células endoteliais.

No entanto, na co-cultura, a resposta endotelial regulada negativamente resulta em recrutamento de neutrófilos suprimido.

Visualize as culturas sob microscopia de contraste de fase para avaliar o recrutamento de neutrófilos do fluxo.

Para o modelo de filtro, primeiro corte um pedaço de Parafilm no mesmo tamanho da lamínula de vidro, usando um gabarito de metal. Em seguida, corte uma ranhura de 20 por 4 milímetros no Parafilm usando um gabarito de metal para criar o canal de fluxo. Use a junta Parafilm para marcar o canal de fluxo na lamínula da tampa de vidro. Alinhe as bordas do filtro de seis poços na lamínula de cobertura de vidro. Certifique-se de que o filtro cubra as marcações do canal de fluxo. Corte cuidadosamente o filtro usando um bisturi tipo 10A.

Em seguida, cubra cuidadosamente o filtro com uma junta Parafilm, certificando-se de que a ranhura do canal de fluxo esteja no meio do filtro. Use um pedaço de lenço de papel limpo e empurre as bolhas para fora. Agora, coloque a lamínula no recesso da placa inferior da câmara de fluxo de perspex.

Posicione a placa superior de perspex sobre a parte superior da junta e aparafuse as placas. Gire a torneira de três vias para permitir que o tampão de lavagem PBS-A flua através da válvula. Em seguida, conecte a tubulação do manômetro à porta de entrada da placa superior de perspe. Execute o PBS-A através do canal de fluxo para permitir a passagem de bolhas.

Em seguida, conecte o tubo do manômetro da bomba da seringa na porta de saída da placa Perspex. Limpe qualquer PBS-A que tenha pingado na placa superior da câmara. Finalmente, coloque a câmara no palco de um microscópio de contraste de fase invertido e ajuste o foco para visualizar as células endoteliais acima dos filtros.

Para perfundir leucócitos sobre as células endoteliais, defina a bomba da seringa para reabastecer e pressione Executar. Uma vez que o foco tenha sido ajustado para visualizar a monocamada de células endoteliais, coloque dois mililitros de neutrófilos purificados no reservatório da amostra e deixe aquecer por dois minutos. Em seguida, lave o endotélio com PBS-A por dois minutos. Ligue a válvula para perfundir neutrófilos sobre o endotélio. Administre o bolus de neutrófilos por quatro minutos. Desligue a válvula e perfunda PBS-A do reservatório de lavagem pelo restante do experimento.

Ao realizar o experimento, certifique-se de que as bolhas de ar não passem em nenhum ponto durante o ensaio, pois isso interromperá a monocamada das células endoteliais e causará o descolamento dos neutrófilos aderentes.

Registre o recrutamento de neutrófilos durante o fluxo de neutrófilos ou pós-perfusão usando um software de captura de imagem digital. Identifique o centro do canal movendo a objetiva para a borda do canal na porta de entrada e identificando o meio da porta. Faça todas as gravações digitais de pelo menos 5 a 10 campos no centro do canal de fluxo.

Durante a gravação durante o fluxo de neutrófilos, tire imagens de um único campo a cada 10 segundos por um minuto. Mova-se ao longo do canal e registre outro campo por um minuto, repetindo esse processo durante o bolo.

Para registrar a pós-perfusão, faça uma gravação de 10 segundos de 5 a 10 campos no centro do canal de fluxo para avaliar o comportamento dos leucócitos. Tire fotos a cada segundo dentro do intervalo de 10 segundos. Isso permite tempo suficiente para que a captura do fluxo e o comportamento dos neutrófilos aderentes sejam analisados.

Registre um único campo contendo pelo menos 10 neutrófilos transmigrados por cinco minutos, tirando imagens a cada 30 segundos. Isso pode ser usado para calcular a velocidade das células migradas. Grave outra série de campos de 10 segundos. Isso permite que os neutrófilos tenham tempo para migrar através da monocamada endotelial.

Por fim, pare a bomba de seringa e remova a tubulação de saída e, em seguida, a tubulação de entrada. Desmonte a câmara de fluxo e enxágue o sample reservatório com PBS-A. Repita para filtros subsequentes e canais de microlâminas antes de prosseguir com a análise do recrutamento e comportamento de leucócitos, conforme descrito no protocolo de texto.