Quantificação baseada em citometria de fluxo de células cancerígenas senescentes induzidas por terapia

Tome células cancerígenas pré-tratadas com um medicamento quimioterápico que induz a senescência em uma porcentagem de células.

Essas células acumulam grânulos de lipofuscina autofluorescentes, um conhecido marcador de senescência.

Adicione um antibiótico que entre nas células e iniba as bombas de prótons lisossômicos, evitando a acidificação lisossômica.

Um aumento no pH inativa as enzimas lisossômicas.

As células senescentes superexpressam a β-galactosidase lisossômica, mesmo em pH quase neutro, tornando-a um biomarcador de senescência.

Introduzir um substrato de β-galactosidase. Incubar.

β-galactosidase hidrolisa o substrato internalizado em um produto fluorescente, marcando as células senescentes.

Centrifugue e descarte o sobrenadante.

Adicione um corante de viabilidade celular. Dentro das células vivas, as esterases ativas convertem o corante em um produto fluorescente impermeável à membrana. As células mortas com integridade de membrana comprometida permanecem sem coloração.

Usando citometria de fluxo, detecte as células viáveis exibindo os marcadores duplos lipofuscina e substrato fluorescente de β-galactosidase, indicando células senescentes.

Quantifique a porcentagem de cé