Quantificação baseada em citometria de fluxo de células cancerígenas senescentes induzidas por terapia

Tome células cancerígenas pré-tratadas com um medicamento quimioterápico que induz a senescência em uma porcentagem de células.

Essas células acumulam grânulos de lipofuscina autofluorescentes, um conhecido marcador de senescência.

Adicione um antibiótico que entre nas células e iniba as bombas de prótons lisossômicos, evitando a acidificação lisossômica.

Um aumento no pH inativa as enzimas lisossômicas.

As células senescentes superexpressam a β-galactosidase lisossômica, mesmo em pH quase neutro, tornando-a um biomarcador de senescência.

Introduzir um substrato de β-galactosidase. Incubar.

β-galactosidase hidrolisa o substrato internalizado em um produto fluorescente, marcando as células senescentes.

Centrifugue e descarte o sobrenadante.

Adicione um corante de viabilidade celular. Dentro das células vivas, as esterases ativas convertem o corante em um produto fluorescente impermeável à membrana. As células mortas com integridade de membrana comprometida permanecem sem coloração.

Usando citometria de fluxo, detecte as células viáveis exibindo os marcadores duplos lipofuscina e substrato fluorescente de β-galactosidase, indicando células senescentes.

Quantifique a porcentagem de células senescentes para demonstrar a eficácia do medicamento.

Primeiro, ajuste o pH lisossômico de amostras de células cultivadas adicionando uma solução de uma bafilomicina A micromolar em DMEM ao pellet celular a uma concentração de uma vez 10 elevado à sexta célula por mililitro e pipeta para misturar. Incube por 30 minutos a 37 graus Celsius em um rotador em baixa velocidade. Em seguida, para corar a beta-galactosidase associada à senescência, adicionar a solução-mãe DDAOG a 10 microgramas por mililitro às amostras sem lavar.

Coloque em um rotador por 60 minutos, protegido da luz direta. Como antes, centrifugue os tubos. Remova o sobrenadante e lave o pellet com um mililitro de BSA 0,5% gelado em PBS. Em seguida, adicione 300 microlitros de solução diluída de violeta de calcina 450 AM aos pellets de células lavadas. Incube por 15 minutos no gelo no escuro.

Transfira as amostras de células para tubos compatíveis com instrumentos de citometria de fluxo. No software de aquisição de dados, abra um histograma de canal violeta e um gráfico de pontos de canal vermelho distante versus canal verde. Inicie a aquisição de dados do citômetro em uma velocidade de entrada baixa e coloque as amostras de controle positivo coradas com DDAOG na porta de entrada. Comece a adquirir dados de exemplo. Ajuste as tensões do canal de forma que mais de 90% dos eventos estejam contidos em cada gráfico.

Quando todas as configurações estiverem ideais, registre 10.000 eventos por amostra. Coloque o controle somente do veículo samples corados com DDAOG na porta de admissão. Inicie a aquisição de dados e registre 10.000 eventos por amostra. Procure um aumento na autofluorescência ou no sinal de FA e DDAO galactosídeo versus controle positivo. Salve os dados de amostra em . FCS e exporte os arquivos para uma estação de trabalho equipada com software de análise de citometria de fluxo.