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Pegue uma placa de fundo plano com vários poços contendo bactérias em meios de crescimento ou bactérias em meios de crescimento suplementados com sal biliar.
Os sais biliares induzem estresse, causando danos celulares e liberando DNA e proteínas. Essas biomoléculas revestem o fundo do poço, permitindo que as bactérias sobreviventes adiram à superfície sólida.
As bactérias ligadas se multiplicam, formando microcolônias e produzindo autoindutores - ou moléculas de sinalização química, permitindo a comunicação bacteriana.
Essa comunicação faz com que as bactérias colonizem e iniciem a produção de substâncias poliméricas extracelulares ou EPS, gerando um biofilme.
Após a incubação, remova o meio para eliminar as bactérias flutuantes.
Introduza uma coloração violeta cristalina que interaja com o peptidoglicano da parede celular bacteriana, dando-lhe uma cor violeta.
Remova o excesso de mancha e seque. Cubra com etanol para solubilizar o cristal violeta da parede celular bacteriana, alterando a cor da solução.
Uma coloração mais intensa em poços tratados com sais biliares do que em poços não tratados confirma a formação de biofilme por meio da adesão à fase sólida.
Primeiro, rotule dois tubos de 1,5 mililitro como TSB e TSB mais BS. Em seguida, adicione 1 mililitro de TSB ou TSB mais BS aos respectivos tubos.
Em seguida, inocular os tubos com 20 microlitros de cultura durante a noite na diluição de 1:50. Em seguida, adicione 130 microlitros de meio de controle não inoculado a cada um dos três poços em uma placa de 96 poços estéril, transparente e tratada com cultura de tecidos de fundo plano. Este será o controle em branco.
Adicione 130 microlitros de cultura inoculada em cada um dos três poços. Após adicionar o controle e a cultura inoculada nos respectivos poços, incubar a placa de 96 poços por 4 a 24 horas a 37 graus Celsius estaticamente. Quando a incubação terminar, coloque o controle em branco no leitor de placas.
Em seguida, aspire o meio de cultura de cada poço. Em seguida, lave suavemente os poços uma vez com 200 microlitros de PBS estéril. Após a lavagem, aspire o PBS e, em seguida, inverta a placa para secar por cerca de 20 minutos.
É muito importante garantir a remoção suave da mídia e uma lavagem suave para garantir que a matriz EPS não seja perturbada.
Em seguida, adicione 150 microlitros de cristal violeta a 0,5% a cada um dos poços experimentais e de controle. Em seguida, incube a placa por cinco minutos em temperatura ambiente. Após cinco minutos, lave os poços uma vez com 400 microlitros de água destilada. Adicione 200 microlitros de água destilada para lavar os poços cinco vezes. Após todas as cinco lavagens, inverta a placa e deixe secar completamente, protegida da luz.
Para obter resultados consistentes, é importante que as amostras sejam bem secas antes de prosseguir.
Depois que a placa estiver completamente seca, use 200 microlitros de etanol a 95% para destituir os poços. Em seguida, deixe a placa no shaker por 30 minutos a 4 graus Celsius para evitar a evaporação. Após 30 minutos, registre o OD540 no leitor de placas.