Um método de preparação de amostras para visualizar bactérias formadoras de biofilme em hifas fúngicas

Introduza uma colônia fúngica ligada ao celofane em uma suspensão bacteriana marcada com fluorescência. Retire o celofane e incuba.

As células bacterianas aderem à superfície do fungo por meio de moléculas e receptores de superfície. As bactérias aderidas secretam substâncias poliméricas extracelulares que consistem em polissacarídeos, proteínas e DNA, prendendo as células bacterianas e formando a base estrutural do biofilme.

Enxágue a seção em uma solução salina forte para remover bactérias frouxamente ligadas

Em um tampão fosfato, corte uma seção da colônia.

Transfira a seção para água estéril contendo aglutinina de gérmen de trigo ou WGA ligado a um corante fluorescente vermelho.

WGA, uma proteína vegetal, liga-se a resíduos de N-acetilglucosamina e ácido siálico, permitindo que o corante ligado fluoresça na parede celular do fungo.

Enxágue a seção em um tampão de fosfato.

Mergulhe parcialmente uma lâmina no buffer. Deixe a seção flutuar sobre ele. Levante suavemente para que a seção assente sem ruptura do biofilme.

Coloque um meio de montagem, seguido de uma lamínula para análise microscópica.

Depois de cultivar a bactéria durante a noite, centrifugue a cultura a 5.000 vezes g por três minutos e, em seguida, suspenda o pellet em 25 mililitros de tampão fosfato de potássio estéril 0,1 molar. Depois de repetir a centrifugação, use o mesmo tampão para ajustar a concentração bacteriana final para 10 elevado à nona célula por mililitro.

Encha uma microplaca de 6 poços com 5 mililitros da suspensão bacteriana. Use uma lâmina de barbear estéril para cortar a membrana de celofane da cultura fúngica em quadrados, com uma única colônia em cada membrana. Em seguida, com uma pinça, remova cuidadosamente os quadrados de celofane contendo hifas do meio sólido e transfira-os para poços individuais da suspensão bacteriana.

Agite suavemente a microplaca até que as colônias de fungos se desprendam do celofane. Em seguida, remova as folhas de celofane deixando as colônias de fungos no prato. Incubar a microplaca com agitação suave a 20 graus Celsius por um tempo, dependendo das cepas utilizadas e do estágio a ser analisado.

Para P. fluorescens BBc6/L. bicolor, incubar as culturas durante 30 minutos para obter biofilmes em fase inicial e até 16 horas para biofilmes maduros. Para remover bactérias planctônicas e bactérias eletrostaticamente ligadas às hifas, enxágue o fungo transferindo-o para uma nova microplaca de 6 poços cheia de solução salina forte. Agite suavemente o prato por 1 minuto.

Transfira o fungo para uma nova microplaca de 6 poços contendo 5 mililitros de tampão fosfato de potássio estéril a 0,1 molar. Agite suavemente o prato por dois minutos e, em seguida, transfira o fungo para um tampão fresco.

Enquanto mantém a colônia de fungos em tampão, use um bisturi para cortar a colônia aproximadamente ao meio. Transfira metade da colônia a ser corada para uma placa de Petri contendo 1 mililitro de água estéril suplementada com um corante fluorescente apropriado para visualizar a rede fúngica, como aglutinina de gérmen de trigo conjugada a Alexa Fluor633. Em seguida, incube a amostra no escuro.

Após a coloração, enxágue a amostra transferindo-a para uma tampa de placa de Petri contendo 10 mililitros de tampão fosfato de potássio molar estéril 0,1 e agite suavemente por 1 minuto. Mergulhe uma lâmina na tampa da placa de Petri e posicione delicadamente a seção cortada para flutuar acima da lâmina. Em seguida, levante lentamente o lado da solução tampão, permitindo que a amostra assente suavemente na lâmina.

O aspecto mais delicado é o posicionamento da amostra na lâmina. Para evitar a ruptura do biofilme, a amostra e a lâmina devem ser imersas durante o posicionamento da amostra, e a amostra não deve mais ser movida antes da imagem.

Por fim, adicione 10 microlitros de meio de montagem anti-desbotamento à amostra e cubra-a com uma lamínula de vidro.