Uma técnica de citometria de fluxo FRET para detectar a agregação de proteína repórter induzida por sementes de Tau

Pegue uma cultura de células de mamíferos expressando o domínio repetido da proteína de ligação aos microtúbulos tau.

Esses repórteres tau citoplasmáticos possuem uma mutação propensa à agregação e existem como monômeros.

Os repórteres são fundidos ao fluoróforo A ou B, com o espectro de emissão do primeiro se sobrepondo ao espectro de absorção do último.

Adicione um lipossoma complexado com sementes de tau ou agregados fibrilares de tau de comprimento total.

Ao entrar na célula, o lipossomo libera as sementes no citoplasma.

As sementes liberadas medeiam a agregação dos repórteres tau, aproximando o fluoróforo A do fluoróforo B.

Adicione tripsina para separar as células e, em seguida, execute a fixação.

Analise as células usando um citômetro de fluxo.

Devido à proximidade dentro do agregado, após a excitação, a transferência de energia do fluoróforo A para B por meio de uma interação dipolo-dipolo é chamada de transferência de energia de ressonância de fluorescência ou FRET.

O fluoróforo B excitado emite um sinal FRET, cuja presença indica agregação de proteínas.

Para recolocar as células do biossensor em condições estéreis, enxágue cada linha celular com PBS quente seguido de uma