Uma técnica de citometria de fluxo FRET para detectar a agregação de proteína repórter induzida por sementes de Tau

Pegue uma cultura de células de mamíferos expressando o domínio repetido da proteína de ligação aos microtúbulos tau.

Esses repórteres tau citoplasmáticos possuem uma mutação propensa à agregação e existem como monômeros.

Os repórteres são fundidos ao fluoróforo A ou B, com o espectro de emissão do primeiro se sobrepondo ao espectro de absorção do último.

Adicione um lipossoma complexado com sementes de tau ou agregados fibrilares de tau de comprimento total.

Ao entrar na célula, o lipossomo libera as sementes no citoplasma.

As sementes liberadas medeiam a agregação dos repórteres tau, aproximando o fluoróforo A do fluoróforo B.

Adicione tripsina para separar as células e, em seguida, execute a fixação.

Analise as células usando um citômetro de fluxo.

Devido à proximidade dentro do agregado, após a excitação, a transferência de energia do fluoróforo A para B por meio de uma interação dipolo-dipolo é chamada de transferência de energia de ressonância de fluorescência ou FRET.

O fluoróforo B excitado emite um sinal FRET, cuja presença indica agregação de proteínas.

Para recolocar as células do biossensor em condições estéreis, enxágue cada linha celular com PBS quente seguido de uma incubação de 3 minutos com tripsina-EDTA. Quando as células se soltarem, interrompa a reação com meio de cultura quente e transfira imediatamente as células para um tubo cônico.

Centrifugar as células, ressuspendendo o pellet em meio fresco. Em seguida, conte as células e faça uma diluição de células mastermix de 3.500.000 células por 13 mililitros de meio. Usando uma pipeta multicanal, transfira lentamente 130 microlitros das células para cada poço de uma placa de 96 poços tratada com cultura de tecidos de fundo plano, tendo o cuidado de colocar as pontas da pipeta no centro dos poços sem tocar no fundo da placa.

Uma vez que as células tenham sido plaqueadas, deixe-as assentar, sem perturbações, por 10 minutos em temperatura ambiente e, em seguida, incube a placa durante a noite a 37 graus Celsius, 5% de dióxido de carbono e maior ou igual a 80% de umidade relativa. No dia seguinte, quando as células biossensoras estiverem 60% a 65% confluentes, combine meio sérico reduzido, reagente de lipossomas e fonte de semente biológica para fazer complexos de transdução.

Em seguida, pipete suavemente 20 microlitros de complexo de transdução na lateral de cada biossensor individual e retorne as células tratadas à incubadora por mais 24 a 48 horas. Antes da colheita, as células não tratadas mostrarão apenas fluorescência difusa. No entanto, as células tratadas com material de semente de tau apresentarão agregados brilhantes após 1 a 2 dias.

Para colher as células, substitua o meio de cultura celular por 50 microlitros de Tripsina-EDTA, interrompendo a reação após 5 minutos com 150 microlitros de meio de cultura resfriado. Imediatamente, transfira as células para uma placa de fundo redondo de 96 poços e peletize as células. Aspire o sobrenadante sem perturbar os pellets e, em seguida, ressuspenda suavemente, mas completamente, as células em 50 microlitros de paraformaldeído a 2% por 10 minutos. Em seguida, gire as células novamente e ressuspenda os pellets em 200 microlitros de tampão de citometria de fluxo resfriado.