Enciclopédia de Experimentos da JoVE
Imunologia
0 visualizações • 3:22 min. • July 8th, 2025
Comece com um tubo contendo vetores separados para os genes de anticorpos de cadeia pesada e de cadeia leve.
Adicione um reagente de transfecção para formar complexos com os vetores.
Transfira essa mistura para as células hospedeiras de mamíferos e incube para internalização.
Adicione um agente antiaglomerante para promover a distribuição uniforme das células transfectadas, melhorando a recuperação e o crescimento celular.
Adicione uma solução antibacteriana-antimicótica para evitar contaminação.
Dentro da célula hospedeira, os vetores se integram ao genoma do hospedeiro.
Após a transcrição do gene, os mRNAs individuais saem do núcleo e passam pela tradução para formar cadeias de anticorpos nascentes.
A dobragem e modificação adequadas das correntes nascentes produzem correntes pesadas e leves.
Essas cadeias se combinam para formar anticorpos totalmente funcionais, que são então liberados no meio extracelular.
Colha o meio e centrifugue. Filtre o sobrenadante.
Passe o filtrado por uma coluna de purificação que permita a ligação seletiva dos anticorpos.
Usando um tampão de eluição, eluir os anticorpos purificados.
Cultive células CHO em 200 mililitros de meio em frascos longos com defletores Erlenmeyer. Combine 5 mililitros de meio CHO freestyle com 50 microgramas de DNA de clone pesado variável e 75 microgramas de DNA de clone leve variável em um tubo de 15 mililitros. Em seguida, bata o tubo. Deixe a mistura em temperatura ambiente por 5 minutos. Adicione 750 microlitros de 1 miligrama por mililitro de estoque de amina de polietileno à solução de DNA e faça um vórtice agressivo por 30 segundos.
Deixe a mistura em temperatura ambiente por mais 5 minutos. Adicione toda a mistura às células CHO agitando manualmente o frasco. Incube imediatamente as células a 37 graus Celsius enquanto agita a 130 RPM.
No dia seguinte, adicione 2 mililitros de agente antiaglomerante 100x e 2 mililitros de solução antimicótica antibacteriana 100x às células. Incubar os frascos a 32 a 34 graus Celsius com agitação a 130 RPM. Continue cultivando as células por 10 a 11 dias, adicionando 10 mililitros de ração triptona N1 e 2 mililitros de suplemento de glutamina 100x a cada cinco dias. Conte as células a cada três dias para garantir que a viabilidade celular permaneça acima de 80%. No dia 10 ou 11, colha o meio para purificação de anticorpos centrifugando a cultura a 3.000 vezes g e 4 graus Celsius por 40 a 60 minutos. Em seguida, filtre o meio transparente com um filtro de frasco de 0,22 micrômetro.
Para purificar os anticorpos, equilibre a coluna de proteína A com dois volumes de coluna de tampão de ligação. Passe o meio filtrado pela coluna a uma taxa de fluxo de 1 mililitro por minuto. Em seguida, lave a coluna com dois volumes de coluna de buffer de associação. Use 5 mililitros de tampão de eluição para eluir o anticorpo em frações de 500 microlitros.