Enciclopédia de Experimentos da JoVE
Imunologia
0 visualizações • 3:03 min. • July 8th, 2025
Tome diluições seriadas de um anticorpo direcionado ao vírus Influenza hemaglutinina, ou HA, uma glicoproteína que consiste em uma cabeça globular e um caule.
Adicione as diluições em células de mamíferos transfectadas que expressam HA ligado à superfície. Os anticorpos se ligam às regiões do caule do HA, formando complexos imunes.
Introduzir células T modificadas expressando receptores Fc e codificando um repórter de luciferase sob o controle do fator de transcrição NFAT.
Durante a incubação, o anticorpo ligado ao HA se liga ao receptor Fc, enquanto a cabeça do HA se liga ao ácido siálico, desencadeando a ativação das células T e aumentando a concentração citosólica de cálcio.
Essa ativação inicia uma cascata de sinalização que resulta na desfosforilação do NFAT, desencadeando sua translocação nuclear.
O NFAT se liga aos seus elementos de resposta no genoma, impulsionando a expressão da luciferase.
Adicione um substrato bioluminescente permeável às células. A luciferase oxida o substrato, produzindo um sinal.
A luminescência diminuída com a diminuição da concentração de anticorpos confirma a ativação de células T mediadas por anticorpos específicos do caule HA.
Para avaliar a capacidade de anticorpos específicos de interesse de atingir as células que expressam hemaglutinina, substitua o sobrenadante das culturas de células infectadas por vírus por 25 microlitros de citotoxicidade mediada por células dependente de anticorpos, ou meio de ensaio ADCC.
Em seguida, em uma placa separada de 96 poços, realizar diluições de 4 vezes dos anticorpos de interesse em meio ADCC triplicado e fresco começando em 10 microgramas por mililitro de acordo com o esquema, e tendo o cuidado de incluir o fundo e nenhum controle de anticorpos.
Quando todo o anticorpo tiver sido diluído, transfira 25 microlitros do anticorpo diluído para os alvéolos correspondentes apropriados na placa de células experimentais e coloque a placa na incubadora de cultura de células. Após 15 minutos, adicione 7,5 vezes 10 às 4ª células efetoras modificadas de Jurkat, expressando o receptor Fc apropriado por poço em 25 microlitros de meio ADCC para um volume final de 75 microlitros de meio ADCC por poço.
Retorne a placa à incubadora de cultura de células por 6 horas, descongelando o tampão do substrato de luciferase em banho-maria a 37 graus Celsius durante a última hora da incubação. Quando o tampão estiver pronto, adicione 75 microlitros de tampão de substrato de luciferase a todos os poços, exceto o poço de controle de fundo, e leia a placa em um luminômetro. A indução de dobras de citotoxicidade mediada por células dependente de anticorpos nas culturas de células transfectadas ou infectadas pode então ser calculada.