Geração de variantes de escape do vírus influenza contra anticorpos neutralizantes

Tome uma suspensão do vírus influenza, contendo cepas selvagens e mutantes.

Uma glicoproteína do envelope viral denominada hemaglutinina, ou HA, liga-se ao ácido siálico na superfície da célula hospedeira, mediando a entrada viral.

Adicione um anticorpo neutralizante em concentrações decrescentes que se liga ao HA, bloqueando o local de ligação do ácido siálico.

As cepas mutantes, portadoras de mutações no HA que ajudam a evitar a neutralização de anticorpos, são denominadas variantes de escape.

Injete a mistura em ovos de galinha embrionados livres de patógenos, entregando os vírus no fluido alantóide e incuba.

Os vírus neutralizados por anticorpos não podem entrar nas células da membrana corioalantóide. Os vírus mutantes não neutralizados entram nas células, se replicam e são liberados no fluido alantóide.

Colha o fluido alantóide contendo a população de vírus.

Introduzir um anticorpo específico para HA em concentrações decrescentes, que neutraliza as outras cepas, exceto as variantes de escape.

Introduza glóbulos vermelhos de galinha ou hemácias. Variantes de escape não neutralizadas se ligam às células, causando a aglomeração de hemácias - denominada hemaglutinação, confirmando a geração de variantes de escape.

Os anticorpos neutralizantes que possuem atividade HI são analisados pela preparação inicial de 4 diluições do anticorpo de interesse em concentrações crescentes em 1 vezes PBS em um volume de 100 microlitros por diluição. Em seguida, prepare um estoque de vírus de 1 milhão de unidades formadoras de placa por mililitro em 1 vezes PBS em um volume de 400 microlitros.

Em seguida, misture 100 microlitros de 1 milhão de unidades formadoras de placas por mililitro de vírus com 100 microlitros de cada diluição de anticorpos ou 100 microlitros de 1 vezes PBS. Incube as amostras por uma hora em uma incubadora a 37 graus Celsius com 5% de dióxido de carbono.

Após o vórtice brevemente, injete 200 microlitros de cada mistura em ovos de galinha embrionados específicos livres de patógenos. Em seguida, incube os ovos a 37 graus Celsius sem dióxido de carbono por 40 a 44 horas. Após a incubação, sacrifique os ovos embrionados infectados pelo vírus, colocando-os a 4 graus Celsius por um mínimo de 6 horas. Em seguida, colha o fluido alantóide dos ovos conforme descrito anteriormente.

Por fim, confirme as variantes de escape realizando o ensaio HI conforme descrito no protocolo de texto.