JoVE Encyclopedia of Experiments
Imunologia
0 vistas • 2:10 min • July 8th, 2025
Prepare uma mistura de transfecção adicionando um polímero catiônico apropriado e vetores de plasmídeo separados para genes de anticorpos de cadeia pesada e de cadeia leve.
O polímero carregado positivamente se liga aos plasmídeos carregados negativamente, formando complexos.
Adicione esta mistura de transfecção a uma placa de vários poços contendo cultura de células renais embrionárias humanas em um meio sem soro e incuba.
Os complexos entram nas células por endocitose, causando inchaço e ruptura endossômicos, liberando-os no citoplasma.
O polímero catiônico produz poros na membrana nuclear, facilitando a entrada do vetor e permitindo sua transcrição, seguida pela tradução em proteínas de cadeia pesada e leve.
Essas proteínas se movem para o retículo endoplasmático, onde as proteínas de cadeia pesada e leve são dimerizadas e ligadas covalentemente por ligações dissulfeto, formando anticorpos.
Os anticorpos viajam para o aparelho de Golgi para modificações pós-traducionais adicionais e são empacotados em vesículas para liberação extracelular.
Colete o meio que contém os anticorpos liberados. Adicione um meio sem soro para geração contínua de anticorpos.
Prepare as células HEK em DMEM suplementado e cultive-as até 75% de confluência em frascos de cultura de 75 centímetros quadrados. Para cada transfecção de cadeia pesada/leve, prepare uma mistura com 1,75 mililitros de DMEM sem soro. Inclua 4,5 microgramas de vetor de cadeia pesada, 3 microgramas de vetor de cadeia leve e 50 microlitros de solução de polietileminina. Adicione delicadamente esta mistura a uma placa de células HEK e agite a solução sobre a placa.
Incube a placa durante a noite e, em seguida, comece a coletar o meio de cultura todos os dias, substituindo-o por meio sem soro. A mídia contém os anticorpos e pode ser coletada diariamente por quatro dias.