Enciclopédia de Experimentos da JoVE
Imunologia
0 visualizações • 3:32 min. • July 8th, 2025
Pegue uma suspensão de células natural killer, ou NK.
Adicione anticorpos monoclonais anti-CD20 e incuba.
Na ausência de células-alvo cancerígenas que expressam o antígeno CD20, a região Fc dos anticorpos se liga aos receptores FcγRIIIa na superfície da célula NK.
Pós-incubação, adicione meios resfriados. Centrifugue e remova os anticorpos não ligados.
Em seguida, adicione anticorpos anti-cadeia leve κ humana. Incubar.
Esses anticorpos secundários se ligam à cadeia leve κ dos anticorpos monoclonais.
A reticulação do anticorpo imita a ligação do antígeno alvo, desencadeando uma cascata de sinalização intracelular.
Isso causa estimulação artificial de células NK na ausência de células cancerígenas.
As células NK ativadas sofrem rearranjo do citoesqueleto e liberam grânulos citotóxicos.
Além disso, as células produzem quimiocinas e citocinas.
Após a duração desejada, adicione meio resfriado para interromper a estimulação celular.
Centrifugue o tubo. Colete o sobrenadante e o pellet celular para análise a jusante das funções das células NK efetoras mediadas por anticorpos.
Dispense 100 microlitros de células natural killer ressuspensas em tubos de 1,5 mililitro ou em uma placa de fundo em U de 96 poços e coloque as células no gelo. Preparar rituximab ou outro anticorpo de interesse a uma concentração de 100 microgramas por mililitro.
Adicione 1 microlitro a cada tubo de células para uma concentração final de 1 micrograma por mililitro e incube as células no gelo por 30 minutos. Durante a incubação, preparar uma solução de anticorpo de cadeia leve kappa humano em meios a uma concentração de 50 microgramas por mililitro. A quantidade de solução de anticorpos necessária será de 50 microlitros por amostra de célula.
Aqueça a solução de anticorpos a 37 graus Celsius em um bloco de calor ou em banho-maria. Quando a incubação das células estiver completa, adicione 1 mililitro de meio gelado a cada tubo e centrifugue as células a 135 vezes g e 4 graus Celsius por 5 minutos. Lave as células novamente com 1 mililitro de meio gelado. Aspire o sobrenadante após a última lavagem e adicione 50 microlitros da solução de anticorpo de cadeia leve kappa anti-humano para ativar as células. Coloque imediatamente as amostras de células a 37 graus Celsius em um bloco de calor ou em banho-maria e incube-as até os pontos de tempo desejados para análise ou outros procedimentos.
A melhor maneira de lidar com várias amostras é usar um rack flutuante em um banho-maria de 37 graus, que pode ser removido e colocado no gelo para interromper todas as reações imediatamente.