Uma técnica para gerar anticorpos monoclonais a partir de células B específicas do antígeno

Pegue os vetores de expressão eucariótica, codificando uma cadeia pesada de anticorpos ou uma cadeia leve de anticorpos, clonados a partir de células B específicas do antígeno.

Introduzir polietilenomina, um polímero catiônico, que interage eletrostaticamente com os vetores carregados negativamente, formando poliplexos.

Incubar células de mamíferos com os poliplexos, que aderem às células e são internalizados via endocitose. Os endossomos resultantes se fundem com os lisossomos.

Os polímeros nos poliplexos causam inchaço osmótico da vesícula, levando à sua ruptura e liberação dos vetores.

Os vetores liberados entram no núcleo e são transcritos em mRNA de cadeia pesada e de cadeia leve, que sofrem tradução via ribossomos no retículo endoplasmático.

As cadeias peptídicas resultantes se reúnem em anticorpos, que são transportados para o Golgi e empacotados em vesículas secretoras.

Após a fusão das vesículas secretoras e da membrana celular, os anticorpos são liberados extracelularmente.

Colha o sobrenadante contendo anticorpos para ensaios a jusante.

Semear 15.000 células renais embrionárias humanas em 200 microlitros de Dulbecco's Modified Eagle Medium suplementado com 10% de soro fetal bovino em cada poço de uma placa de fundo plano de 96 poços, um dia antes da transfecção. Em seguida, incube a placa a 37 graus Celsius durante a noite a 5% de dióxido de carbono. Cotransfectar as células usando um reagente de transfecção derivado de polietilenoimina linear. Diluir 0,5 microlitros de reagente de transfecção de DNA com 10 microlitros de 150 milimolares de cloreto de sódio.

Em seguida, diluir 0,125 microgramas de cada vetor variável de cadeia pesada e leve em 10 microlitros de cloreto de sódio 150 milimolar. Vortex todas as diluições por 10 segundos cada. Em seguida, misture o reagente de transfecção de DNA previamente diluído com 10 microlitros de solução de DNA. Rapidamente vórtice a mistura de transfecção de DNA por 15 segundos e incube por 15 minutos em temperatura ambiente.

Adicione a mistura de transfecção de DNA gota a gota nas células e, em seguida, gire suavemente a placa. Substitua o meio 16 horas após a transfecção e cultive as células por cinco dias em meio sem soro a 37 graus Celsius.