Enciclopédia de Experimentos da JoVE
Imunologia
0 visualizações • 2:28 min. • July 8th, 2025
Pegue uma coluna FPLC contendo uma resina de vidro porosa com proteína A imobilizada - uma proteína bacteriana de ligação a anticorpos. Equilibre a coluna com um tampão de pH neutro.
Adicione fluido de cultura de células colhido de células ovarianas de hamster chinês, contendo anticorpos monoclonais e proteínas contaminantes e DNA.
A proteína A se liga à região Fc do anticorpo, imobilizando-o.
Alguns contaminantes se ligam de forma não específica à resina, enquanto o restante flui.
No cromatograma, um aumento da absorbância de UV durante o carregamento da amostra indica uma alta concentração de proteína no fluxo.
Lave com o tampão de equilíbrio para remover contaminantes não ligados, indicados por uma diminuição na absorbância.
Lave com um tampão com alto teor de sal, interrompendo as interações não específicas e removendo os contaminantes, indicados por um pequeno pico de impurezas.
Adicione um tampão de eluição de baixo pH para interromper a interação do anticorpo Proteína A e elui os anticorpos, que são coletados rastreando o pico correspondente.
Neutralize o pH dos anticorpos coletados para evitar a degradação.
Comece abrindo o software conectado ao sistema de purificação e colocando tubos cônicos de 15 mililitros para coletar o eluato de anticorpos purificado e tubos cônicos de 50 mililitros para coletar o fluxo durante a lavagem com alto teor de sal no coletor de frações.
Em seguida, adicione fluido de cultura de células colhidas com filtro de poros de 0,22 micrômetro a uma seringa vazia de 12 mililitros com um bico tampado. Depois de remover a tampa, insira o bico da seringa na porta de injeção manual do sistema de purificação. Gire a seringa para apertá-la no lugar e pressione o êmbolo até que todo o volume da amostra tenha sido injetado e seja visível no laço de amostra de grande volume de 10 mililitros anexado.
Selecione o método salvo e clique em Executar quando solicitado pelo software do instrumento. Quando todo o anticorpo tiver sido eluído, neutralize imediatamente a proteína purificada com 1 molar tris base a um pH de cerca de 5,5.