Enciclopédia de Experimentos da JoVE
Imunologia
0 visualizações • 5:01 min. • July 8th, 2025
Tome soro humano diluído em série e inativado por calor contendo vírus sincicial respiratório ou anticorpos neutralizantes específicos para VSR.
Adicione a suspensão viral. Os anticorpos neutralizam os vírus de maneira dependente da diluição.
Introduzir a mistura nas monocamadas de células epiteliais humanas e incubar para adsorção viral.
Descarte a mistura. Adicione meios contendo carboximetilcelulose, formando uma camada semi-sólida. Incubar.
O VSR utiliza a maquinaria da célula hospedeira para sintetizar RNA e proteínas virais, que subsequentemente se montam e brotam como vírions individuais.
As células infectadas eventualmente morrem. A carboximetilcelulose restringe o movimento do vírus, causando infecção localizada e morte celular, formando placas.
Remova a sobreposição.
Fixe as células com um tampão contendo acetona. Introduza um tampão de bloqueio contendo detergente para permeabilizar as células e evitar interações inespecíficas de anticorpos.
Adicione anticorpos primários direcionados a proteínas virais.
Sobreposição com anticorpos secundários conjugados com fluoróforo direcionados aos anticorpos primários.
Imagem dos poços para quantificar placas fluorescentes.
A maior diluição sérica neutralizando cinquenta por cento do VSR representa o título de neutralização.
Antes da inoculação de células A549 com VSR, examine a placa celular sob um microscópio óptico para confirmar que as monocamadas de células A549 são 80% confluentes. Em seguida, inverta a placa suavemente para descartar a mídia e seque levemente a placa em uma toalha de papel absorvente estéril. Após cada lavagem com PBS filtrado e estéril.
Em seguida, adicione 100 microlitros por poço da mistura vírus-soro aos poços correspondentes na placa de células A549 de acordo com o modelo de placa fornecido no manuscrito e incube a placa a 37 graus Celsius em 5% de dióxido de carbono por uma hora. No final da incubação, use uma pipeta para remover 90 microlitros por poço e adicione 100 microlitros do meio contendo 1X M 199, 1,5% CMC e 2% de FCS e mistura de penicilina-estreptomicina. Incube a placa a 37 graus Celsius em 5% de dióxido de carbono por três dias.
Para fixar e desenvolver uma placa de ensaio, primeiro inverta a placa de células A549 infectada com VSR suavemente para descartar o meio contendo M 199, CMC, FCS a 2% e mistura de penicilina-estreptomicina. Em seguida, adicione lentamente 200 microlitros do tampão de fixação a cada poço. Incube a placa a menos 20 graus Celsius por 20 minutos. Em seguida, descarte o tampão de fixação e seque suavemente em uma toalha de papel absorvente.
Deixe o prato virado para baixo para secar por 10 minutos. Em seguida, com tampão PBS filtrado contendo 0,05 polissorbato-20, faça 5% de solução bloqueadora do leite. Adicione 200 microlitros da solução de bloqueio a cada poço e incube a placa em temperatura ambiente por 30 minutos. No final da incubação, inverta a placa suavemente para descartar a solução e seque em uma toalha de papel absorvente.
Para produzir o anticorpo primário, dilua 1 a 500 anticorpos Goat X RSV na solução de bloqueio. Adicione 50 microlitros a cada poço e incube a placa a 37 graus Celsius por uma hora. Lave a placa três vezes com polissorbato PBS filtrado.
Em seguida, faça o anticorpo secundário diluindo 1 a 5.000 imunoglobulinas G anti-cabra AlexaFluor Donkey na solução de bloqueio. Adicione 50 microlitros a cada poço e incube a 37 graus Celsius por uma hora. Lave a placa cinco vezes com polissorbato PBS filtrado.
Para contar placas com um leitor automático de manchas, primeiro use uma placa de cultura de 96 poços não utilizada para calibrar o instrumento inserindo as configurações de contagem no canal FITC. Em seguida, leia a placa celular, embrulhe-a em papel alumínio e guarde-a a 4 graus Celsius. Em seguida, verifique as imagens de poços em busca de placas artefactuais ou monocamadas de células interrompidas e exclua poços com monocamadas de células interrompidas.