Um método baseado em imunofluorescência para visualização de células de tufo em criosseções de jejuno

0 views • 3:31 min • July 8th, 2025

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Comece com uma placa de cultura contendo crioseções de jejuno de camundongo fixadas em formalina e cheias de gelatina, apresentando células de tufo com microvilosidades apicais e soma em forma de carretel.

Lave com um tampão contendo detergente para permeabilizar as membranas celulares.

Adicionar uma solução alcalina de recuperação de antigénio. Incube para quebrar as ligações cruzadas de proteínas induzidas pela fixação, revelando as proteínas para coloração.

Aplique uma solução de bloqueio para evitar a ligação de anticorpos não específicos.

Sobreposição com anticorpos primários direcionados a uma proteína de ligação à actina, especificamente fosforilada em células de tufo.

Remova os anticorpos não ligados. Introduza uma mistura de anticorpos secundários conjugados com fluoróforo, corante de ligação ao DNA e conjugado de corante fluorescente de faloidina.

Os anticorpos secundários se ligam aos anticorpos primários, o conjugado de corante fluorescente de faloidina marca a actina e o corante de ligação ao DNA marca os núcleos das células.

Remova os componentes não ligados e adicione um tampão sem detergente.

Transfira a seção para uma lâmina de vidro revestida com adesivo, montando-a com mídia.

Sob um microscópio confocal, células verdes em forma de carretel com fluorescência intensificada na ponta luminal e uma massa de radícula vermelha estendida indicam a presença de células de tufo.

Para preparar seções de jejuno, comece ajustando a temperatura da câmara do criostato e a temperatura do objeto para menos 22 graus Celsius. Coloque o bloco de tecido congelado em um molde criogênico na câmara do criostato por pelo menos 15 minutos. Após 15 minutos, corte o bloco ao meio com uma lâmina de barbear para expor a seção transversal do jejuno. Monte metade do bloco em um adaptador de criostato. Divida o jejuno cheio de gelatina em seções de 30 mícrons de espessura. Use uma pinça congelada para transferir suavemente as seções para uma placa de cultura de 35 milímetros contendo 3 mililitros de PBS.

Depois de lavar as seções três vezes por 5 minutos cada uma com 3 mililitros de PBS-T, adicione 3 mililitros de solução de recuperação de antígeno recém-preparada ao prato que contém as seções flutuantes. Em seguida, feche a tampa, sele o espaço entre o prato e a tampa com uma tira de fita adesiva e incube a 50 graus Celsius em uma incubadora de hibridização por três horas sem agitar.

Após a imunocoloração, transferir a placa de cortes corados em PBS para um microscópio estereoscópico. Coloque 200 microlitros de PBS em uma gota no centro de uma lâmina de vidro branco revestida com AMS. Em seguida, use uma ponta de pipeta P200 para transferir uma seção do jejuno do prato para a gota.

Depois de ajustar o alinhamento da seção, aspire todo o PBS restante ao redor da seção. Adicione 20 microlitros de mídia de montagem aquosa e coloque uma lamínula sobre a mídia. Sele imediatamente as bordas da lamínula com mídia de montagem à base de xileno e deixe secar por duas a três horas antes de iniciar a microscopia confocal.

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Órgão Cultura e Whole Mount Imunofluorescência Coloração de rato Wolff Dutos

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Last updated: 18 July 2026