Enciclopédia de Experimentos da JoVE
Imunologia
0 visualizações • 3:03 min. • July 8th, 2025
Pegue uma coluna de cromatografia de afinidade contendo grânulos de agarose conjugados à proteína A, uma proteína de ligação a anticorpos.
Adicione um tampão de ligação com um pH neutro para equilibrar a coluna.
Carregue o sobrenadante da cultura a partir de uma cultura de células produtoras de anticorpos, contendo anticorpos monoclonais e proteínas celulares contaminantes.
O pH neutro facilita a ligação da proteína A à região Fc dos anticorpos enquanto os contaminantes fluem.
Meça a absorbância UV do fluxo para criar um cromatograma. Uma alta absorbância durante o carregamento da amostra indica proteínas não ligadas no fluxo.
Lave a coluna com o tampão de ligação para remover contaminantes não especificamente ligados.
Adicione um tampão de eluição com pH baixo para interromper a interação entre a proteína A e o anticorpo. Colete os anticorpos eluídos monitorando o pico de absorbância.
Neutralize o pH para evitar a degradação do anticorpo e transfira para um filtro centrífugo.
Centrifugue para concentrar os anticorpos e ressuspenda em um tampão para ensaios a jusante.
Depois de preparar buffers e inicializar o sistema FPLC de acordo com o protocolo de texto, use o editor de métodos
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