JoVE Encyclopedia of Experiments
Imunologia
0 vistas • 3:03 min • July 8th, 2025
Pegue uma coluna de cromatografia de afinidade contendo grânulos de agarose conjugados à proteína A, uma proteína de ligação a anticorpos.
Adicione um tampão de ligação com um pH neutro para equilibrar a coluna.
Carregue o sobrenadante da cultura a partir de uma cultura de células produtoras de anticorpos, contendo anticorpos monoclonais e proteínas celulares contaminantes.
O pH neutro facilita a ligação da proteína A à região Fc dos anticorpos enquanto os contaminantes fluem.
Meça a absorbância UV do fluxo para criar um cromatograma. Uma alta absorbância durante o carregamento da amostra indica proteínas não ligadas no fluxo.
Lave a coluna com o tampão de ligação para remover contaminantes não especificamente ligados.
Adicione um tampão de eluição com pH baixo para interromper a interação entre a proteína A e o anticorpo. Colete os anticorpos eluídos monitorando o pico de absorbância.
Neutralize o pH para evitar a degradação do anticorpo e transfira para um filtro centrífugo.
Centrifugue para concentrar os anticorpos e ressuspenda em um tampão para ensaios a jusante.
Depois de preparar buffers e inicializar o sistema FPLC de acordo com o protocolo de texto, use o editor de métodos para configurar as etapas de execução da seguinte maneira. Equilibre o sistema com cinco volumes de coluna ou CV de buffer de ligação.
Carregue a amostra na coluna e colete o fluxo da amostra e, em seguida, use cinco CV de buffer de ligação para lavar o sistema. Use cinco CV de tampão de eluição para eluir a coluna por meio de fracionamento isocrático. e coletar as amostras de anticorpos purificadas como frações usando o coletor de frações.
Finalmente, equilibre o sistema com cinco CV de buffer de ligação e colete o fluxo em um recipiente de resíduos. Quando a configuração do método estiver concluída, especifique o volume de meio condicionado a ser aplicado à coluna e salve o método.
Em seguida, mergulhe a tubulação da bomba de amostra no recipiente que contém o meio condicionado. Em seguida, prepare um recipiente separado para coletar o fluxo de amostra através da tubulação de saída especificada. Insira os tubos de coleta no coletor de frações e adicione tampão de neutralização a cada tubo de coleta. No módulo de controle do sistema do software, abra o método a ser usado. Em seguida, clique em Iniciar para iniciar a execução.
Quando a purificação estiver concluída e o módulo de avaliação, verifique o cromatograma resultante. Combine todas as frações contendo proteínas em um tubo e, em seguida, use PBS e um dispositivo de filtro centrífugo com um corte de 30 kilodalton para concentrar a amostra e realizar a troca de tampão. Por fim, use o ensaio BCA para medir a concentração de anticorpos de acordo com as instruções do fabricante.