Enciclopédia de Experimentos da JoVE
Imunologia
0 visualizações • 4:18 min. • July 8th, 2025
Pegue uma seção do cérebro murino consistindo do giro dentado do hipocampo, um local para neurogênese composto por progenitores neuronais em estágios distintos de diferenciação.
Transfira a seção para uma solução de bloqueio de permeabilização. As moléculas de detergente na solução permeiam as células, enquanto as proteínas bloqueiam os locais de ligação não específicos.
Adicione um coquetel de anticorpos primários direcionados a marcadores específicos de neurogênese, uma proteína associada a microtúbulos e uma proteína de filamento intermediário.
Remova os anticorpos não ligados. Introduza diferentes anticorpos secundários marcados com fluoróforo ligando-se aos anticorpos primários.
Adicione proteínas séricas do mesmo hospedeiro como um dos anticorpos primários, saturando os paratopos dos anticorpos secundários.
Introduzir fragmentos monovalentes de Fab que saturam os epítopos das proteínas séricas, impedindo a ligação não específica.
Adicione um segundo anticorpo primário criado no mesmo hospedeiro, ligando-se a outra proteína de filamento intermediário.
Introduzir anticorpos secundários marcados com fluoróforo direcionados ao segundo anticorpo primário.
Usando microscopia de fluorescência, identifique os subtipos de progenitores neuronais que expressam combinações únicas de marcadores.
Comece transferindo as seções da solução anticongelante para TBS com a ajuda de um pincel fino. Enxágue bem as seções, começando com uma lavagem noturna a 4 graus Celsius, seguida de cinco lavagens de 10 minutos em temperatura ambiente. Todas essas incubações devem ser realizadas com agitação suave e contínua.
Se um dos antígenos de interesse for um análogo da timidina, uma etapa de desnaturação do ácido clorídrico deve ser implementada neste ponto, seguida por uma etapa de neutralização no tampão borato. Prossiga com a permeabilização e o bloqueio dos locais inespecíficos de ligação de anticorpos no TBS-plus. Deixe esta incubação agir por 1 hora em temperatura ambiente.
Em seguida, incube no primeiro anticorpo primário diluído em TBS-plus durante a noite a 4 graus Celsius. No dia seguinte, lave as seções três vezes em TBS e uma vez em TBS-T. Deixe cada banho agir por 10 minutos. Em seguida, incubar no primeiro anticorpo secundário conjugado com fluorocromo por três horas em temperatura ambiente. A partir de agora, proteja as seções da exposição à luz.
Após outra série de lavagens, transfira as seções para uma solução de soro da espécie hospedeira a 10% a partir da qual os dois anticorpos primários foram feitos. Incubar as secções nesta solução durante três horas para saturar os paratopos abertos no primeiro anticorpo secundário. Mais tarde, enxágue três vezes em TBS e uma vez em TBS-T para remover o soro.
Em seguida, prepare uma solução de TBS-plus com 50 microgramas por mililitro de fragmentos monovalentes não conjugados de Fab dirigidos contra as espécies hospedeiras do anticorpo primário. Isso cobre os epítopos que poderiam ser reconhecidos pelo segundo anticorpo secundário. Transfira as seções para esta solução e incube durante a noite a 4 graus Celsius.
Após a incubação, enxágue as seções pelo menos três vezes em TBS e uma vez em TBS-T. Durante as transferências, limpe as inserções de malha contendo as seções em uma toalha de papel para remover os restos residuais de Fab. Agora, incube as seções no segundo anticorpo primário durante a noite a 4 graus Celsius.
Após outra série de lavagens, aplicar o segundo anticorpo secundário durante três horas à temperatura ambiente. Por fim, lave as mechas três vezes em TBS e prossiga com a montagem das mechas em gelatina. Seque as lâminas ao ar e aplique-as usando um meio de montagem anti-desbotamento.