Uma técnica de imunomarcação para visualizar a localização subcelular de proteínas

Comece lavando uma seção cardíaca fixa em um tampão de cacodilato de sódio que estabiliza a estrutura do tecido. Mergulhe a seção em tetraóxido de ósmio para corar os lipídios da membrana.

Trate com acetato de sódio para manter um pH ideal para a coloração.

Adicione acetato de uranila para corar biomoléculas, proporcionando melhor contraste durante a microscopia.

Desidratar o tecido em concentrações crescentes de etanol seguido de acetona.

Incorpore o tecido em uma resina, obtenha cortes ultrafinos e transfira-os para uma grade de microscopia.

Introduzir meta-periodato de sódio para remover o tetraóxido de ósmio, desmascarando a proteína celular.

O composto também oxida a glicoproteína, criando grupos aldeídos reativos, que são neutralizados pelo tratamento com glicina.

Introduzir um tampão de bloqueio, impedindo a ligação de anticorpos não específicos.

Adicione anticorpos primários específicos para a proteína alvo seguidos por anticorpos secundários biotinilados.

Adicione pontos quânticos conjugados com estreptavidina que se ligam à biotina.

Sob um microscópio eletrônico, as regiões marcadas com pontos quânticos exibem maior contraste, auxiliando na localização subcelular precisa da proteína-alvo.

Após 24 horas da fixação, lave o tecido em tampão cacodilato de sódio 0,1 molar duas vezes por 20 minutos. Remova o tecido do tampão de cacodilato de sódio e mergulhe em solução de tetróxido de ósmio a 2% por 4 horas em temperatura ambiente.

Após a osmicação, mergulhe o tecido em solução de acetato de sódio a 2% por 10 minutos em temperatura ambiente. Em seguida, mergulhe o tecido em solução de acetato de uranila a 2% por 1 hora em temperatura ambiente. Após a coloração com acetato de uranila, desidrate o tecido sequencialmente através dos álcoois graduados e acetona.

Incorpore o tecido desidratado em resina epóxi de baixa viscosidade, conforme descrito no manuscrito. Coloque o tecido em resina fresca em micromoldes de 8 milímetros, moldes e cure o tecido embutido a 70 graus Celsius durante a noite. Depois de encontrar a área de interesse usando uma faca ultra 45 graus, produza seções ultrafinas de ouro claro. Coloque essas seções ultrafinas no lado opaco de uma grade de cobre de 200 mesh.

Comece a coloração desmascarando o antígeno colocando 20 microlitros de metaperiodato de sódio em um filme de parafina limpo. Coloque a grade seca com seções de tecido na gota da solução de gravação. Deixe a grade de seção na solução por 30 minutos em temperatura ambiente. Lave as seções de tecido gravadas colocando-as em uma gota de água destilada por 60 segundos.

Bloqueie os aldeídos residuais colocando a grade de seção em uma gota de solução de glicina 0,05 molar por 10 minutos à temperatura ambiente. Seque as bordas da grade em papel de filtro para remover a solução de glicina residual. Coloque a grade de seção em 10 a 20 microlitros de solução de bloqueio por 25 minutos em temperatura ambiente.

Seque as bordas da grade em papel de filtro e coloque as seções da grade em diluente de anticorpos para condicionamento em temperatura ambiente por 10 minutos. Incube as seções da grade com anticorpo primário por 1 hora e 30 minutos em uma câmara umidificada. Seque a grade e lave as seções da grade com diluente de anticorpos duas vezes por 5 minutos cada.

Incubar as secções da grelha com anticorpo secundário biotinilado durante 1 hora numa câmara humidificada. Depois que a grade estiver seca, lave as seções da grade com diluente de anticorpos duas vezes por 5 minutos cada. Incube as seções da grade em QD conjugado com estreptavidina disponível comercialmente por 1 hora em uma câmara umidificada à temperatura ambiente. Evite a exposição à luz cobrindo a câmara com papel alumínio. Depois de secar as bordas da grade com papel de filtro, lave as seções da grade colocando-as em gotas de água por dois minutos e seque as bordas da grade para secar.