Um ensaio de imunofluorescência para detectar agregados de alfa-sinucleína em uma seção de biópsia de pele

Faça a criossecção de uma biópsia de pele de um paciente com doença de Parkinson envolta em um meio de inclusão.

O tecido compreende uma epiderme mais externa, uma derme subjacente e gordura subcutânea inervada por nervos.

Lave a seção para remover o meio de incorporação. Transfira-o para uma solução de bloqueio de permeabilização, permeabilizando as células e bloqueando locais de ligação não específicos.

Mergulhe a seção em um coquetel de anticorpos primários para obter uma marcação uniforme de anticorpos, denominada coloração flutuante.

Os anticorpos entram nos neurônios e se ligam a agregados de alfa-sinucleína distribuídos ao longo dos axônios - uma forma agregada característica de doenças neurodegenerativas - e hidrolases carboxila-terminal.

Introduza anticorpos secundários conjugados com fluoróforo que se ligam aos anticorpos primários.

Trate com um corante de ligação de DNA fluorescente que mancha o núcleo.

Coloque o tecido em uma lâmina, aplique um meio de montagem e sele com uma lamínula.

Sob um microscópio confocal, a fluorescência de ambos os anticorpos revela a presença de agregados de alfa-sinucleína ao longo dos axônios dos neurônios dérmicos.

Para começar, encha alguns dos poços de uma placa nova de 96 poços com 100 microlitros de solução de lavagem. Transferir as secções a analisar da placa de armazenamento para a que contém a solução de lavagem. Deixe as mechas na solução de lavagem por 10 minutos em temperatura ambiente. Em seguida, transfira cada seção para um poço vazio contendo a mesma solução de lavagem e repita a lavagem. Em seguida, adicione uma solução de lavagem às seções e transfira-as para novos poços contendo 100 microlitros de solução de bloqueio. Incube em temperatura ambiente por pelo menos 90 minutos e no máximo 4 horas.

Diluir os anticorpos primários, anti-PGP9.5 e anti-5G4 na solução de trabalho. Transfira as seções para novos poços contendo 100 microlitros da solução de trabalho dos anticorpos primários e incube durante a noite em temperatura ambiente.

No dia seguinte, lave as seções em poços contendo solução de lavagem conforme descrito anteriormente. Dilua os anticorpos secundários - anti-coelho de cabra para detectar anti-PGP9.5 e anti-camundongo de cabra para detectar 5G4 na solução de trabalho.

Transfira as seções lavadas para novos poços contendo 100 microlitros da solução de trabalho dos anticorpos secundários. Cubra a placa com papel alumínio para evitar o branqueamento do fluoróforo conjugado com anticorpos secundários e incube em temperatura ambiente por 90 minutos.

Depois disso, lave as seções duas vezes em solução de lavagem conforme descrito anteriormente. Transfira as seções lavadas para novos poços contendo 100 microlitros de DAPI por 5 minutos em temperatura ambiente. Lave as seções duas vezes em solução de lavagem conforme descrito anteriormente. Em seguida, monte as seções em um slide na posição correta, evitando dobras incorretas.

Adicione algumas gotas de meio de montagem ao slide e cubra a seção com uma lamínula. Deixe as lâminas secarem durante a noite. No dia seguinte, guarde as lâminas em uma caixa apropriada a 4 graus Celsius, certificando-se de evitar a exposição à luz.

Usando um microscópio de fluorescência invertida ou um microscópio confocal, visualize as seções. Adquira as imagens por uma câmera conectada ao microscópio. Em seguida, use um microscópio de fluorescência ou um microscópio confocal para analisar sinais positivos em seções, em termos de distribuição espacial e intensidade do sinal, conforme descrito no protocolo de texto.