Detecção de anticorpos antiglicanos circulantes com uma matriz de glicanos impressa

Comece com um glicochip funcionalizado com sub-matrizes de glicanos impressas organizadas em blocos de matrizes.

Cada ponto no sub-array representa um glicano distinto - um polímero à base de carboidratos com variações na composição de monossacarídeos, comprimento da cadeia e padrão de ramificação.

Trate o glicochip com um tampão de bloqueio para bloquear locais de interação não específicos.

Transfira o glicochip e introduza soro de camundongo diluído em um tampão suplementado com surfactante para minimizar a agregação de anticorpos. Incubar sob agitação.

A agitação promove a distribuição uniforme do soro, facilitando a ligação seletiva de anticorpos antiglicanos a glicanos específicos com base em características moleculares distintas.

Lave com concentrações decrescentes de um tampão contendo surfactante para perturbar a ligação não específica e enxágue.

Cubra o glicochip com anticorpos secundários conjugados com biotina de camundongo, interagindo com anticorpos antiglicanos pré-ligados e lave.

Introduza estreptavidina marcada com fluoróforo, ligando-se a anticorpos secundários biotinilados. Lave e remova o excesso de solução.

Examine o glicochip e observe se há manchas de fluorescência distintas em várias posições, sugerindo anticorpos circulantes específicos para glicano no soro.

Prepare o buffer #1 até o buffer #4 conforme descrito no protocolo de texto. Para preparar os glicochips e amostras, coloque a caixa de armazenamento com as lâminas sobre a mesa até que atinjam a temperatura ambiente. Abra a caixa e transfira o glicochip para a câmara de incubação, que já deve estar condicionada com papel de filtro úmido para manter a umidade constante dentro da câmara.

Enquanto isso, dilua o soro de camundongos com tampão 1 em tubos de 1,5 mililitro. Homogeneizar a solução de soro por 5 segundos com um misturador de vórtice. Após a homogeneização, incubar o soro diluído a 37 graus Celsius por 10 minutos em banho-maria para evitar a agregação de imunoglobulinas. Em seguida, centrifugue os tubos por 3 minutos a 10.000 vezes g e 25 graus Celsius.

Recolher o sobrenadante e rejeitar qualquer material precipitado. Coloque o glicochip cuidadosamente na câmara de incubação. Incube-o com 1 mililitro de tampão #3 para eliminar qualquer material residual na superfície do glicochip. Por 15 minutos, a 25 graus Celsius, segure o glicochip na posição vertical e lave-o novamente com algumas gotas de tampão # 3 usando uma pipeta Pasteur de plástico.

Em seguida, remova cuidadosamente o tampão da superfície do glicochip usando papel de filtro. Coloque o glicochip de volta na câmara de incubação. Espalhar a amostra de soro diluído sobre a superfície do glicochip com uma micropipeta. Certifique-se de que todas as áreas secas da superfície do glicochip sejam cobertas pela amostra de soro diluído usando a ponta da pipeta.

Incubar com agitação orbital a 37 graus Celsius por 1 hora e meia. Após a incubação, remova qualquer excesso de amostra e mergulhe o glicochip por 5 minutos no tampão #3 a 25 graus Celsius. Passe o glicochip para um recipiente com tampão #4 e, finalmente, lave o glicochip com água ultrapura.

Centrifugue o glicochip por 1 minuto a 175 vezes g e 25 graus Celsius para remover o líquido. Depois de colocar o glicochip de volta na câmara de incubação, espalhe uma solução de anti-rato de cabra conjugada à biotina sobre a superfície do glicochip. Incubar com agitação orbital a 37 graus Celsius por uma hora. Remova a fração não ligada e repita as etapas de lavagem.

Após a centrifugação, incubar o glicochip na escuridão a 25 graus Celsius por 45 minutos com 2 microgramas por mililitro da solução de estreptavidina marcada com fluorocromo correspondente no tampão #2. Depois de trabalhar no escuro para remover a fração não ligada e repetir as etapas de lavagem, seque o glicochip por via aérea.

Para escanear a matriz, deixe o glicochip na mesa até atingir a temperatura ambiente no escuro. Ao mesmo tempo, ligue o scanner de slides e o laser. Segurando o microarray, deslize o glicochip no slot até que ele toque a parte de trás. Escaneie o glicochip executando o Easy Scan e salve o escaneamento como um arquivo .tiff.