Imunolocalização de proteínas e pectinas de arabinogalactana em tecido vegetal

Pegue uma lâmina com poços de reação contendo seções finas de diferentes tecidos vegetais. Os tecidos são fixados e embutidos dentro de uma resina para imunocoloração.

Coloque a lâmina dentro de uma câmara de incubação escura e úmida para evitar a exposição à luz e a evaporação do reagente durante as etapas subsequentes.

Introduzir uma solução de bloqueio para evitar a interação inespecífica de anticorpos.

Lave para remover o excesso de solução de bloqueio e, em seguida, adicione anticorpos primários específicos do antígeno e incuba.

Os anticorpos se ligam aos seus antígenos-alvo, ou seja, proteínas arabinogalactana e pectinas na parede celular.

Introduza anticorpos secundários conjugados com fluoróforo, que se ligam aos anticorpos primários.

Lave para remover os anticorpos não ligados e aplique um corante fluorescente que se liga à celulose, marcando a parede celular.

Adicione um meio de montagem e sele com uma lamínula.

Sob um microscópio, a fluorescência do corante e os anticorpos ligados ajudam a visualizar a celulose nas paredes celulares das plantas colocalizadas com proteínas arabinogalactana ou pectina, exibindo sua distribuição específica do tecido.

Para preparar uma câmara de incubação para as lâminas de reação, coloque algumas toalhas de papel umedecidas no fundo de uma caixa de pontas de pipeta e embrulhe a caixa com papel alumínio. Transfira as lâminas da caixa para a câmara de incubação. Pipete 50 microlitros de solução de bloqueio em cada poço. Depois de incubar a lâmina por 10 minutos, remova a solução de bloqueio. Em seguida, lave todos os poços duas vezes com PBS por 10 minutos de cada vez. Depois de preparar as soluções de anticorpos primários conforme descrito no manuscrito, realize uma lavagem final dos poços com água destilada e deionizada por 5 minutos.

Pipetar a solução de anticorpos primários para os alvéolos de reacção. Em seguida, pipete a solução de bloqueio para os poços de controle. Feche a câmara de incubação. Deixe repousar por duas horas em temperatura ambiente e depois leve à geladeira durante a noite a 4 graus Celsius. Prepare uma solução a 1% do anticorpo secundário na solução de bloqueio. Serão necessários aproximadamente 40 microlitros por poço.

Cubra a solução com papel alumínio. Lave os poços da lâmina de reação duas vezes com PBS e uma vez com água destilada e deionizada por 10 minutos de cada vez. Certifique-se de que nenhuma solução de bloqueio ou depósitos permaneçam nos poços. Pipetar a solução de anticorpos secundários em todos os alvéolos. Incube as lâminas no escuro em temperatura ambiente por 3 a 4 horas.

Novamente, lave os poços da lâmina de reação duas vezes com PBS e uma vez com água destilada e deionizada. Em seguida, adicione uma gota de calcofluor-branco a cada poço. Sem lavar, adicione uma gota de meio de montagem a cada poço e cubra cada poço com uma lamínula. Observe as seções de amostra na lâmina de reação usando um microscópio de fluorescência.

Para cada observação, use um filtro UV para detectar paredes celulares coradas pelo calcofluor e um filtro FITC para detectar imunolocalização. Para uma melhor visualização dos resultados, use o ImageJ ou um programa de análise de imagem semelhante para mesclar cada imagem de filtro UV com a imagem de filtro FITC correspondente.