Usando um sanduíche ELISA para determinar o conteúdo de glicoproteína imunogênica em uma vacina

Comece com uma placa de ensaio passivada revestida com anticorpos monoclonais imunogênicos específicos para glicoproteínas antirrábicas e um agente bloqueador para evitar interações inespecíficas.

Introduzir vacinas antirrábicas diluídas em série e testar vacinas antirrábicas com conteúdo decrescente de glicoproteínas. Sele a placa para evitar contaminação.

Durante a incubação, as glicoproteínas imunogênicas interagem com anticorpos monoclonais revestidos por meio de um local antigênico específico.

Após a incubação, remova o filme, aspire o sobrenadante e lave a placa.

Sobreposição com anticorpos monoclonais específicos de glicoproteína conjugada com enzima que se ligam a um local antigênico diferente na glicoproteína, formando um imunocomplexo.

Adicionar uma solução contendo um substrato e um cromógeno. Quando o substrato interage com a enzima, causa a oxidação do cromógeno, alterando a cor da solução.

Adicione uma solução de parada para inativar as enzimas.

Meça a absorbância e gere uma curva de referência usando os valores de referência da vacina.

Identificar a região onde existe uma relação linear entre a absorvância e o teor de glicoproteínas das diluições da vacina de referência. Em seguida, extrapole o conteúdo de glicoproteína das diluições da vacina de teste com base na absorbância que se enquadra nessa região.

Para lavar a lâmina, adicione 300 microlitros do tampão de lavagem a cada poço. Em seguida, aspire cuidadosamente e transfira o conteúdo do poço para um recipiente contendo uma solução de hipoclorito de sódio a 2,6%. Repita este processo de lavagem mais cinco vezes para lavar extensivamente a placa sensibilizada.

Em seguida, inverta a microplaca e deixe secar em um pedaço de papel absorvente em temperatura ambiente por um minuto. Reconstituir a vacina de referência num mililitro de água destilada de modo a que a concentração final de glicoproteína do vírus da raiva seja de 10 microgramas por mililitro. Preparar uma diluição de 10 vezes da vacina de referência reconstituída no diluente para atingir uma concentração de glicoproteína do vírus da raiva de um micrograma por mililitro.

Em seguida, execute seis diluições duplas em série desta vacina de referência no diluente, conforme descrito na tabela um do protocolo de texto. Distribua 200 microlitros do diluente em poços duplicados para servir como controle em branco e 200 microlitros por poço para cada diluição da vacina de referência em duplicata.

Em seguida, prepare uma diluição de 10 vezes da vacina testada no diluente e prepare sete diluições seriadas duplas da vacina testada no diluente, conforme descrito na tabela dois do protocolo de texto. Distribua 200 microlitros de cada diluição de vacina testada em duplicata para cada poço da microplaca. Cubra a microplaca com filme adesivo e incube a 37 graus Celsius por uma hora.

Depois disso, remova o filme, aspire cuidadosamente e transfira o conteúdo de cada poço para um recipiente contendo uma solução de hipoclorito de sódio a 2,7%. Para lavar a placa, adicione 300 microlitros de tampão de lavagem a cada poço. Aspire cuidadosamente e transfira o conteúdo de cada poço para um recipiente contendo uma solução de hipoclorito de sódio a 2,6%.

Repita o processo de lavagem mais cinco vezes para remover o antígeno não ligado. e conserve os trímeros de proteína G ligados ao anticorpo revestido. Inverta a microplaca lavada e deixe secar em um pedaço de papel absorvente em temperatura ambiente por um minuto. Em seguida, distribua 200 microlitros da diluição recomendada de anticorpo monoclonal D1 marcado com peroxidase em diluente para cada poço.

Cubra a microplaca com filme adesivo e incube a 37 graus Celsius por uma hora. Em seguida, remova o filme, aspire cuidadosamente e transfira o conteúdo de cada poço para um recipiente contendo uma solução de hipoclorito de sódio a 2,6%. Para lavar a microplaca, adicione 300 microlitros de tampão de lavagem a cada poço.

Aspire cuidadosamente e transfira o conteúdo de cada poço para um recipiente contendo uma solução de hipoclorito de sódio a 2,6%. Repita este processo de lavagem mais cinco vezes para remover o anticorpo marcado com peroxidase não ligado. Inverta a microplaca de lavagem e deixe secar em um pedaço de papel absorvente em temperatura ambiente por um minuto.

Em seguida, distribua 200 microlitros de solução de cromogênio de substrato em cada poço. Sele a microplaca com filme e incube em temperatura ambiente no escuro por 30 minutos. Em seguida, adicione 50 microlitros de solução de parada em cada poço para interromper a reação.

Com cuidado, limpe a parte inferior da microlâmina e coloque-a em um espectrofotômetro. Determine a densidade óptica em 492 nanômetros para todos os poços usados. Colete esses dados em um arquivo de planilha para análise. Depois disso, crie gráficos para a curva da vacina de referência e os valores de densidade óptica, conforme descrito no protocolo de texto.