Imunomarcação de células encapsuladas em um sistema de hidrogel 3D

Pegue uma placa de vários poços contendo células de mamíferos encapsuladas em um sistema de hidrogel imitando o ambiente natural da matriz extracelular.

Remova o meio de cultura. Trate com um tampão de fixação para reticular as proteínas, preservando a integridade celular.

Adicione uma solução contendo detergente para permeabilizar a membrana celular.

Introduzir uma solução de bloqueio para evitar a ligação de anticorpos não específicos nas etapas subsequentes.

Adicione um coquetel de anticorpos primários que entra nas células e se liga especificamente aos filamentos intermediários citoplasmáticos e ao fator de transcrição alvo.

Remova os anticorpos não ligados. Introduza anticorpos secundários marcados com fluorescência e uma coloração nuclear para marcar o DNA com fluorescência.

Remova as moléculas não ligadas.

Monte a cultura de hidrogel em uma lâmina usando um meio de montagem.

Use um microscópio confocal para observar as células imunomarcadas.

Primeiro, aspire o meio de cada poço. Em seguida, lave os poços com 1 mililitro de DPBS quente. Após a conclusão da lavagem, adicione 750 microlitros de solução de fixação a cada poço. Em seguida, incube a placa de 24 poços a 37 graus Celsius por 30 minutos. Após a incubação, aspire a solução de fixação de cada um dos poços e descarte o fixador em um recipiente de resíduos perigosos. Em seguida, adicione 1 mililitro de DPBS à amostra e descarte imediatamente o DPBS em um recipiente de resíduos perigosos.

Em seguida, adicione 750 microlitros de solução de permeabilização para permeabilizar a amostra por uma hora em temperatura ambiente no balancim, a 15 rotações por minuto. Após uma hora, aspire a solução de permeabilização e adicione 750 microlitros de solução de bloqueio à amostra. Deixe a amostra no balancim em temperatura ambiente por três horas. Em seguida, dilua os anticorpos primários desejados com a solução de diluição de anticorpos.

Em seguida, adicione 500 microlitros da solução de anticorpos a cada amostra. Incube as amostras durante a noite a 4 graus Celsius. No dia seguinte, aspire a solução primária de anticorpos. Em seguida, lavar as amostras com PBST durante uma hora três vezes, à temperatura ambiente, a 15 rotações por minuto.

Em seguida, diluir os anticorpos secundários apropriados e 5 mg/ml de solução-mãe DAPI para atingir uma concentração final de 2,5 microgramas por mililitro. Em seguida, adicione 500 microlitros da solução a cada amostra. Em seguida, use papel alumínio para cobrir a placa de 24 poços e incube a placa a 4 graus Celsius durante a noite.

No dia seguinte, aspire a solução de anticorpos secundários e lave as amostras com PBST três vezes, cada uma por 30 minutos em temperatura ambiente em um balancim. Em seguida, posicione uma gota de meio de montagem rígido na superfície de uma lâmina de vidro e coloque a amostra no meio de montagem. Por fim, use esmalte para selar as amostras na lâmina da tampa de vidro para evitar contaminação ou movimento da amostra.