Avaliando a distribuição intracelular de conjugados de anticorpos modificados por peptídeos derivados de vírus

Comece com células eritroblásticas humanas aderidas.

Introduzir conjugados de anticorpos modificados por peptídeos derivados de vírus. Esses conjugados contêm uma sequência de localização nuclear, ou NLS, do vírus e um resíduo de ácido cólico.

Durante a incubação, os conjugados de anticorpos interagem com os receptores da superfície celular e se internalizam nos endossomos.

O ácido cólico no conjugado ajuda a escapar do compartimento endossômico, permitindo o acúmulo intracelular, enquanto as proteínas de transporte e NLS facilitam sua localização nuclear.

Introduza tripsina e tampão contendo EDTA para separar as células e remover os conjugados ligados à superfície.

Adicione meios enriquecidos com soro para inibir a atividade da tripsina.

Centrifugue para coletar as células; fixe-as e permeabilize-as.

Introduza anticorpos secundários marcados com fluoróforo vermelho-distante, ligando-se a conjugados localizados e lave.

Trate com um corante de coloração nuclear.

Observe sob um microscópio confocal e capture imagens em várias profundidades planares.

Após o processamento da imagem, a célula mostra pequenos focos fluorescentes verdes dentro do citoplasma e do núcleo, confirmando a distribuição intracelular dos conjugados de anticorpos.

Trate as células-alvo TF-1a com 200 conjugados de anticorpo de ácido cólico 7G3 nanomolar. Inclua células tratadas com anticorpos monoclonais de controle modificados. Incubar 5 x 10⁶ células positivas para antígenos com os conjugados a 37 graus Celsius por uma hora. Em seguida, remova o sobrenadante e use um mililitro de PBS gelado para lavar as células três vezes.

Adicione meio fresco e incube as células a 37 graus Celsius por mais uma hora. Em seguida, adicione 0,5 mililitros de PBS contendo 0,25% de tripsina e EDTA e incube as células a 37 graus Celsius por até 30 minutos. Em seguida, use 1,5 mililitros de meio RPMI-1640 com 10% de FBS para neutralizar a tripsina.

Centrifugar as células a 500 vezes g durante cinco minutos. Remova o sobrenadante e use 0,5 mililitros de PBS gelado para lavar as células três vezes novamente. Adicione 0,5 mililitros de PFA a 1% e sacarose a 1% em PBS às células e coloque-as no gelo por 30 minutos para corrigi-las.

Em seguida, use 0,5 mililitros de PBS gelado para lavar as células três vezes e centrifugue as amostras a 250 vezes g por cinco minutos. Em seguida, adicione 0,15% de Triton X-100 em PBS às células e permeabilize-as no gelo por cinco minutos. Em seguida, com PBS gelado, lave as células e repita a centrifugação.

Suspenda as células em 0,1 mililitros de PBS contendo dois microgramas por mililitro de um anticorpo policlonal secundário Fc antimurino conjugado ao AlexaFluor 647 e incube as amostras no escuro em temperatura ambiente por uma hora. Centrifugue as células a 250 vezes g por cinco minutos e use 0,5 mililitros de PBS gelado para lavar as células três vezes.

Em seguida, ressuspenda as células em 0,5 mililitros de PBS. Adicione 10 microgramas por mililitro de iodeto de propídio às células. Em seguida, use o meio de montagem para montar 1 x 10⁵ células em lâminas de vidro antes de cobrir a amostra com uma lamínula de vidro. Examine as células com uma objetiva de imersão em óleo Plan Apo 60X, abertura numérica de 1,42, em um microscópio confocal de varredura a laser invertido.

Detecte a fluorescência PI usando o laser de argônio de 488 nanômetros e o prisma de varredura espectral definido para 600 a 650 nanômetros. Para fluorescência AF 647, use o laser de hélio-neônio de 633 nanômetros e o prisma de varredura espectral definido para 650 a 700 nanômetros. Colete imagens de P1 e AF 647 sequencialmente, 1024 x 1024 pixels com média de linha 2X tiradas em intervalos de 0,5 mícron em toda a espessura da célula. Apresente imagens como projeções Z.

Para analisar as células, avalie e registre se a fluorescência intracelular no citoplasma está agrupada e próxima à superfície celular ou difusa e homogênea. Além disso, avalie a intensidade relativa de fluorescência por célula.