Uma técnica in vitro para estudar o tráfego de receptores de glutamato em neurônios do hipocampo

Pegue três amostras de culturas neuronais do hipocampo em lamínulas.

Introduzir anticorpos primários para marcar os receptores de glutamato expressos na superfície.

Adicione um meio condicionado à segunda e terceira amostras para induzir a endocitose dos receptores ligados a anticorpos.

Na terceira amostra, adicione fragmentos de Fab para bloquear epítopos nos anticorpos não endocitados.

Introduza um inibidor para bloquear a endocitose do receptor enquanto permite a reciclagem do receptor para a superfície.

Em todas as amostras, fixe as células e adicione uma solução de bloqueio para evitar a rotulagem não específica.

Introduzir anticorpos secundários marcados com fluoróforo para rotular os anticorpos primários nos receptores ligados à superfície, incluindo os reciclados.

Permeabilize as membranas celulares.

Adicione o anticorpo primário novamente à primeira amostra para rotular os receptores endocitados pré-existentes.

Introduzir um anticorpo secundário marcado com fluoróforo diferente em todas as amostras para rotular os anticorpos primários ligados ao receptor endocitado, distinguindo entre receptores endocitados e ligados à superfície.

Usando um microscópio confocal, quantifiqu