Um ensaio in vitro para medir a fagocitose celular dependente de anticorpos por fagócitos

Pegue microesferas marcadas com fluorescência conjugadas a um antígeno de interesse. Os antígenos imobilizados estão ligados a anticorpos específicos do antígeno.

Adicione leucócitos, incluindo linfócitos não fagocíticos, granulócitos fagocíticos e monócitos. Incubar a mistura em condições fisiológicas.

A região Fc do anticorpo imobilizado se liga ao receptor Fc no fagócito, desencadeando a fagocitose celular dependente de anticorpos, ou ADCP.

Centrifugue para pellet as células e descarte o sobrenadante contendo microesferas não internalizadas.

Adicione uma mancha de viabilidade que entre nas células mortas, marcando-as fluorescentemente.

Centrifugue para pellet as células e remova o sobrenadante.

Adicione anticorpos marcados com fluorescência que se ligam aos leucócitos.

Centrifugue para descartar o sobrenadante e fixar as células.

Usando citometria de fluxo, primeiro, elimine as células mortas que são positivas para a mancha de viabilidade.

Em seguida, selecione os leucócitos viáveis e discrimine entre granulócitos, monócitos e linfócitos com base em suas propriedades de granularidade e espalhamento.

Meça a intensidade de fluorescência das células fagocíticas positivas para microesferas para quantificar sua atividade de ADCP.

Para um ensaio ADCP, inverta rapidamente a placa ADCP preparada para decantar o sobrenadante após a centrifugação final e adicione 5 x 10⁴ células de leite materno recém-isoladas em 200 microlitros de PBS mais BSA para uma incubação de 2 horas a 37 graus Celsius.

No final da incubação, centrifugue as células e lave os pellets duas vezes em 200 microlitros de PBS fresco, conforme demonstrado. Após a última lavagem, corar as células com 0,5 microgramas por mililitro de corante de viabilidade fixável, 450 por poço e 50 microlitros de PBS por 30 minutos em temperatura ambiente, protegidos da luz.

No final da incubação, pulverizar as células por duas lavagens em PBS fresco, conforme demonstrado, e corar as células para os marcadores leucocitários de interesse por 30 minutos à temperatura ambiente, protegidos da luz. Ao final da incubação, coletar as células por centrifugação e lavá-las duas vezes em 200 microlitros de BSA a 1% mais PBS por lavagem.

Após a última lavagem, fixe os pellets em 200 microlitros de formaldeído a 0,5% por poço por 30 minutos em temperatura ambiente, protegido da luz. Para análise de citometria de fluxo das amostras de células, defina um citômetro de fluxo equipado com um leitor de placas de alto rendimento para retirar 175 microlitros de amostra e coletar 5.000 células por poço.

Execute o gating inicial para eliminar dupletos e detritos em um gráfico de dispersão direta versus dispersão lateral. Use um gráfico de coloração de dispersão lateral versus viabilidade para eliminar as células mortas e use um gráfico de dispersão lateral versus CD45 para diferenciar as principais classes de leucócitos.

Para todas as células CD45-positivas, ou para cada subconjunto de leucócitos de interesse, medir a atividade de fagocitose celular dependente de anticorpos por meio de um marcador nas células positivas para esferas em um histograma do canal de fluoróforo apropriado para as esferas conjugadas. Em seguida, calcule os escores de fagocitose celular dependente de anticorpos como a mediana da intensidade de fluorescência das células positivas para grânulos pela porcentagem do CD45 total mais as células da população positiva.